表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT6

1、表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT6張海1，師長(zhǎng)宏1，王麗梅2，薛瑩2，柏銀蘭2，徐志凱【關(guān)鍵詞】分枝桿菌,結(jié)核；疫苗,DNA；ESAT6；FP10；交融卵白；免疫原性IungeniityfDNAvaineexpressingESAT6FP10fusinprtEinfybateriutuberulsis【Abstrat】AI:TevaluatethehuralandellulariunerespnseinduedbytheDNAvaineexpressingESAT6FP10fusinprteinandttestitsprtetiveeffiayagainstybateriutuberulsis(TB)

2、hallenge.ETHDS:BALB/ieereiunizedintrausularlythreetiesith100grebinantplasidpDNAe610.Teeksafterlastiunizatin,thespeifiantibdytiterandthestiulatinindex(SI)fspleenlyphytesfrtheiunizedieereeasured,andthelevelsfIFNandIL2andtheativityfantigenspeifiTLeredeteted.TheDNAvainevainatedBALB/ieereinfetedith1105FU

3、(lnyfringunit)TBH37Rvthrughtailvein.Fureekslater,thebaterialadinspleenasdeterined.RESULTS:ThetiterfseruspeifiantibdyinBALB/ieiunizedithDNAvaineas1800.TheSIfDNAvaineiunizedgrups(2.420.13)assignifiantlyhigherthanthatfsalineiunizedgrup.TheIFN(244912)ng/LinduedbyDNAvaineasntdifferentfrthatinbaillusalett

4、eguerin(BG)iunizedgrup,hileIL2(19816)ng/LinduedbyDNAvainehadsignifiantdifferenefrthatfsalineiunizedgrupandaslerthanthatfBGiunizedgrup.TheantigenspeifiTLeffiayas42%.parediththesalineiunizedie(baterialadas6.510.13),adraatiredutinfTBrepliatinasbservedinthespleen(baterialadas4.510.23,P0.05)fBALB/ieiuniz

5、edithDNAvainefllingasubsequenthallenge,buttheprtetiveeffiayfDNAvaineaslerthanthatfBGvaine.NLUSIN:DNAvaineexpressingESAT6FP10fusinprteinhasaiuntherapeutieffettpreventtuberulsis.【Keyrds】ybateriutuberulsis;vaines,DNA;ESAT6;FP10;fusinprtein;iungeniity【關(guān)鍵詞】分枝桿菌，結(jié)核；疫苗，DNA；ESAT6；FP10；交融卵白；免疫原性1質(zhì)料和要領(lǐng)1.2要領(lǐng)2.

6、1免疫小鼠血清特異性抗體滴度DNA疫苗免疫BALB/小鼠3次后，其血清中的特異性抗體滴度均勻?yàn)?800.BG免疫組中只存在抗TBFP抗體，不存在抗ESAT6FP10交融卵白抗體；同時(shí)生理鹽水陰性比擬組的小鼠血清抗ESAT6FP10卵白抗體全部為陰性.2.2免疫小鼠抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖DNA疫苗能誘導(dǎo)免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖，其刺激指數(shù)為2.420.13，但其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖顯著不及BG(3.430.13)，而生理鹽水比擬組淋巴細(xì)胞的增殖不明顯，刺激指數(shù)為0.900.16.2.3脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IFN程度免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液在體外用刺激后，IFN含量明顯增長(zhǎng)，DNA疫苗免疫組為24491

7、2ng/L，明顯高于生理鹽水陰性比擬組42916ng/L，與BG免疫組253015ng/L無(wú)顯著不同.2.4脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IL2程度DNA疫苗誘導(dǎo)免疫小鼠IL2表達(dá)量增長(zhǎng)，含量為19816ng/L；而生理鹽水比擬組只有5416ng/L，均低于BG免疫組29817ng/L.2.5特異性TL殺傷效應(yīng)DNA疫苗誘導(dǎo)的殺傷活性為42圖1，比生理鹽水組和BG組高，但不及H37Rv組62.圖1免疫小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性檢測(cè)略2.6免疫小鼠對(duì)TB毒株打擊的對(duì)抗作用TBH37Rv毒株熏染免疫小鼠4k后，DNA疫苗免疫組脾臟荷菌數(shù)(4.510.23)對(duì)TB有必然對(duì)抗力，但不及BG免疫比擬組4.110.2

8、5，P0.05，高于生理鹽水比擬組(6.510.13).3討論在抗TB熏染歷程中，DNA疫苗已被證明能誘導(dǎo)長(zhǎng)期庇護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答.DNA疫苗那么可引起猛烈的D8+T細(xì)胞反響，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗原特異性D8+/D4-/D44highT細(xì)胞，排泄IFN，引起有用的細(xì)胞免疫5TB的排泄卵白PT64,Ag85B和ESAT6是DNA疫苗精良的候選抗原，研究創(chuàng)造這些DNA疫苗有較高的庇護(hù)作用，將三種重組質(zhì)粒團(tuán)結(jié)免疫動(dòng)物所誘導(dǎo)的庇護(hù)作用比單獨(dú)利用一種質(zhì)粒結(jié)果要好6，提示DNA疫苗將來(lái)研制計(jì)謀有大概向交融型基因疫苗生長(zhǎng).交融型DNA疫苗可以是抗原抗原交融，也但是抗原細(xì)胞因子的交融.ESAT6和FP

9、10是效應(yīng)性T細(xì)胞的重要靶抗原，可誘導(dǎo)T細(xì)胞敏捷增殖和開(kāi)釋高程度的IFN，有用地激活巨噬細(xì)胞，操縱TB熏染.研究表白單獨(dú)編碼ESAT6的基因疫苗的庇護(hù)作用比PT64強(qiáng)，但這兩種DNA疫苗的庇護(hù)作用并未到達(dá)BG的免疫結(jié)果7，以是必要參加其他免疫刺激源，如細(xì)胞因子或其他庇護(hù)性抗原，才氣獲得精良結(jié)果.基于此我們將TB中兩個(gè)庇護(hù)性卵白交融后構(gòu)建成具有庇護(hù)作用的基因疫苗，試圖加強(qiáng)基因疫苗的庇護(hù)結(jié)果.ESAT6和FP10基因僅存在于少數(shù)致病性分枝桿菌中，而不存在于BG及其他非致病分枝桿菌8，因此在BG免疫小鼠血清未檢測(cè)到ESAT6和FP10的抗體.別的在檢測(cè)TL活性時(shí)，由于BG缺失這兩個(gè)基因，BG免疫小鼠

10、脾細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)這兩種抗原的特異性免疫應(yīng)答，如以BG作為交融卵白誘導(dǎo)TL活性的陽(yáng)性比擬就不克不及準(zhǔn)確反響重組疫苗的免疫應(yīng)答程度，因此我們?cè)跈z測(cè)TL活性時(shí)除設(shè)立正常BG免疫組外，又設(shè)立了TBH37Rv毒株免疫組作為陽(yáng)性比擬，以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)重組疫苗的TL活性.DNA疫苗一樣平常要接種3次，BG臨床接種步伐為1次，故在庇護(hù)力實(shí)行中，BG組毒株打擊時(shí)間是在初免后6k舉行，而DNA疫苗組是在末次免疫完后2k舉行.Th1型免疫應(yīng)答誘發(fā)產(chǎn)生的IFN是操縱TB在體內(nèi)生長(zhǎng)生殖的緊張因素，它可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其發(fā)揮殺菌作用.IFN由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生，能加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗分枝桿菌活性，其機(jī)制大概與增長(zhǎng)過(guò)氧

11、化氫和N產(chǎn)生有關(guān).我們的研究創(chuàng)造ESAT6FP10交融卵白基因疫苗能誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)的IFN與BG比擬也無(wú)顯著差距，表白表達(dá)ESAT6FP10交融卵白的DNA疫苗免疫結(jié)果較好，可在TB防治中發(fā)揮緊張作用.【參考文獻(xiàn)】2BerthetF,RasussenP,RsenkrandsI,etal.AybateriutuberulsispernendingESAT6andanvelllelarassulturefiltrateprtEin(FP10)J.irbilgy,1998,144(11):3195-3203.3張海，師長(zhǎng)宏，薛瑩，等.結(jié)核分枝桿菌esat6fp10交融基因疫苗構(gòu)建及表達(dá)J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，263：193-195.4SabrkJ,FritshEF,aniatisT.leularlning:alabratryanual.NeYrk:ldspringharbrlabratrypress:1999:1613-16195LrieDB,SilvaL.EnhaneentfiunpeteneintuberulsisbyDNAvainatinJ.Vaine,2000,18(16):1712-1716.6KaathAT,FengG,adnald,etal.DifferentialprtetiveeffiayfDNAvainesexpre