無菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、無菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程無菌檢查法是檢查要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及要求無菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。事實(shí)上，若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌污染。無菌檢查法有薄膜過濾法、直接接種法兩種方式。細(xì)菌培養(yǎng)溫度32.52.5，真菌培養(yǎng)溫度25.52.5。1 無菌檢查的環(huán)境無菌檢查的所有操作均需在嚴(yán)格控制微生物污染的環(huán)境下進(jìn)行，操作環(huán)境的無菌保證程度將直接影響無菌檢查用潔凈室（區(qū)）環(huán)境的穩(wěn)定性，確保檢查結(jié)果的可考性，對潔凈室（區(qū)）的環(huán)境質(zhì)量采取合理的控制措施和評價方法是必要的。無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級和局部潔凈度100級的單向留空氣區(qū)域

2、內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程筆削嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。無菌室應(yīng)采光良好、避免潮濕、遠(yuǎn)離廁所及污染區(qū)。面積一般不超過10m2，不小于5m2；高度不超過2.4m。由12個緩沖間、操作間組成（操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對），操作間與緩沖間之間應(yīng)具備滅菌功能的樣品傳遞箱。在緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆、毛巾、無菌衣褲放置架及掛鉤、拖鞋等，不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物；無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻壁與地面、

3、天花板連接處應(yīng)呈凹弧形，無縫隙，不留死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。無菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過濾的單向流空氣裝置，操作區(qū)潔凈度100級或放置同等級別的超凈工作臺，室內(nèi)溫度控制1826，相對濕度45%65%。緩沖間及操作室內(nèi)均應(yīng)設(shè)置能達(dá)到空氣消毒效果的紫外燈或其他適宜的消毒裝置，空氣潔凈級別不同的相鄰房間之間的靜壓差應(yīng)大于5Pa，潔凈室（區(qū)）與室外大氣的靜壓差大于10Pa。無菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300lx。緩沖間和操作間所設(shè)置的紫外線殺菌燈（22.5W/m3），應(yīng)定期檢查輻射強(qiáng)度，要求在操作面上達(dá)40Wcm-2。不符合要求的紫外殺菌燈應(yīng)及時更換。無菌室應(yīng)

4、每周和每次操作前用0.1%新潔爾滅或2%甲酚液或其他適宜消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角，開啟無菌空氣過濾器及紫外燈殺菌1小時。在每次操作完畢，同樣用上述消毒溶液擦拭工作臺面，除去室內(nèi)濕氣，用紫外燈殺菌半小時。無菌室的潔凈度檢查 無菌室在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)，以此來判斷無菌室是否達(dá)到規(guī)定的潔凈度，常有沉降菌和浮游菌測定方法。沉降菌檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)：以無菌方式將3個營養(yǎng)瓊脂平板帶入無菌操作室，在操作區(qū)臺面左、中、右各放1個；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將碟蓋蓋好，置32.52.5培養(yǎng)48小時，取出檢查，3個平板上生長的菌落數(shù)平均不超過1個。浮游菌檢測方法

5、及標(biāo)準(zhǔn)：用專門的采樣器，宜采用撞擊法機(jī)理的采樣器，一般采用狹縫式或離心式采樣器，并配有流量計和定時器，嚴(yán)格按儀器說明書的要求操作并定期校驗(yàn)，采用器和培養(yǎng)皿進(jìn)入被測定房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，使用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或藥典認(rèn)可的其他培養(yǎng)基。使用時，先開動真空泵抽氣，時間不少于5分鐘，調(diào)節(jié)流量、轉(zhuǎn)盤、轉(zhuǎn)速。關(guān)閉真空泵，放入培養(yǎng)皿，蓋上采樣器蓋子后調(diào)節(jié)縫隙高度。置采樣口于采樣點(diǎn)后，依次開啟采樣器、真空泵，轉(zhuǎn)動定時器，根據(jù)采樣量設(shè)定采樣時間。全部采樣結(jié)素后，將培養(yǎng)皿置32.52.5培養(yǎng)48小時，取出檢查，浮游菌落數(shù)平均不得過5個/m3。每批培養(yǎng)基應(yīng)選定3只培養(yǎng)皿做對照培養(yǎng)。無菌操作臺面或超凈

6、工作臺還應(yīng)定期請有關(guān)部門檢測其懸浮粒子，應(yīng)達(dá)到100級（一般用塵埃粒子計數(shù)儀）檢測塵埃粒徑0.5的粒數(shù)不得超過3.5個/升，5m的粒數(shù)為0，空氣流速應(yīng)0.35m/s，可根據(jù)無菌狀況必要時置換過濾器。2 儀器及用具2.1 無菌室內(nèi)應(yīng)準(zhǔn)備好盛有消毒用5%甲酚或其他適宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇燈、火柴、鑷子、75%乙醇棉、碘狀棉等。2.2 恒溫培養(yǎng)箱及生化培養(yǎng)箱。2.3 離心機(jī)、生物顯微鏡、真空架、高壓蒸汽滅菌器、標(biāo)準(zhǔn)pH比色器（0.02%酚磺酞指示液和溴麝香草酚藍(lán)指示液）、恒溫烤箱、開放或全封閉過濾系統(tǒng)。2.4 玻璃器皿 試管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10

7、ml）、雙碟等，用玻璃洗滌劑或清潔液浸泡，水洗3次。如使用過程中與細(xì)菌接觸（已污染），應(yīng)先滅菌倒出內(nèi)容物后再清洗，晾干。凡無菌操作過程中所用的器皿，都應(yīng)用牛皮紙包扎嚴(yán)密，滅菌。移液管、刻度吸管在管內(nèi)上端，塞少許原棉，以手感不松不緊為宜，然后放于吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋內(nèi)，封嚴(yán)，滅菌待用；試管、離心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉膠（或硅膠）專用塞或紗布棉塞，塞子應(yīng)塞進(jìn)管口內(nèi)2/3處，用牛皮紙將管口（包括塞子）包扎嚴(yán)，滅菌待用；將注射器、針頭（9號、11號、12號）配對，檢查針頭是否暢通后，將注射芯、管和針頭分別放在雙層紗布（或布）內(nèi)，包扎嚴(yán)密，置帶蓋容器（瓷盤或鋁制飯盒）內(nèi)，蓋嚴(yán)，用牛皮紙包扎后，滅

8、菌待用。長柄取樣匙，放于不銹鋼長筒內(nèi)，蓋嚴(yán)，干熱滅菌待用。手術(shù)鑷、手術(shù)剪洗凈、擦干。用雙層紗布將1把剪刀與1把別字間隔包扎在一起，放于帶蓋的容器（瓷盒或鋁制飯盒）內(nèi)，蓋嚴(yán)，用牛皮紙包扎，滅菌（參照附錄XV 滅菌法）待用。高壓蒸汽滅菌的物品取出時切勿立即置冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸汽冷凝造成負(fù)壓，易染菌，取出后應(yīng)置恒溫培養(yǎng)箱（或干燥箱）中烘干，待用。2.5 無菌衣、褲、帽、口罩等洗凈晾干，配套，用牛皮紙包嚴(yán)，滅菌待用或用一次性的無菌物品代替。2.6 除菌濾器及濾膜 有多種開放式及封閉式濾器用于過濾除菌。微孔濾膜直徑50mm、孔徑約0.45m。新購入封閉式濾器或?yàn)V膜，需進(jìn)行孔徑大小的測試，一般有三種方法

9、，選其中一種方法即可。氣泡法 先將濾膜浸入說中，使完全濕潤，然后用鑷子夾住一片濾膜放于氣泡點(diǎn)測定裝置過濾膜孔徑測定儀上，膜上放一塊與濾膜大小相同的尼龍篩網(wǎng)，再加上多孔板，將螺旋補(bǔ)丁圈旋緊，在多孔板上加35mm深的水（注意排除氣泡）關(guān)閉放氣閥，啟動空壓機(jī)或氮?dú)馄块y，使壓力緩緩上升，注意觀察水面上產(chǎn)生第一個氣泡時，記錄壓力表的壓力，氣泡點(diǎn)壓力不應(yīng)小于2.2kg/cm2（0.2MPa）。水流量法 將濾膜裝于除菌濾器上，開動真空泵，壓力在700mmHg（93kPa）下，抽濾已濾清的水約500ml，計算出每1min的濾速。2005年版中國藥典對濾膜的濾速未明確規(guī)定，而USP（XX）規(guī)定在700mmHg（

10、93kPa）壓力下，濾膜直徑47mm；流速5575ml/min。細(xì)菌過濾法 常用的細(xì)菌為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens CMCC（B）41002），將該菌的新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，32.52.5，培養(yǎng)1820小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-3（約相當(dāng)于7105cfu/ml），取此菌液1ml加至50ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，按薄膜過濾法過濾，取該濾液5ml接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基40ml中，32.52.5培養(yǎng)24小時，應(yīng)無菌生長。不符合規(guī)定的濾膜不得使用。3 菌種及菌液制備菌種的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第

11、0代；冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種，為第一代）。原始菌種購到后，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，接收菌種時應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和菌種的名稱及每一支安瓿的完整性。并在相應(yīng)的菌種接收登記表上記錄所有關(guān)于菌種的信息。將安瓿存于20，使用時首先需要復(fù)活凍干菌種（按菌種保藏中心提供相關(guān)資料操作），一般包括以下步驟：冷凍菌種的復(fù)活 清潔安瓿（可用75%的酒精或碘狀）后，用砂輪在安瓿上部三分之一處劃痕，用干燥的無菌紗布包裹安瓿，將安瓿掰開，用一無菌吸管吸取適量0.50.8ml的液體培養(yǎng)基（生孢梭菌用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌用營養(yǎng)肉湯；白色念珠菌、黑曲霉菌用液體真菌培養(yǎng)基）滴加到

12、安瓿中，輕輕旋轉(zhuǎn)安瓿并吹打，使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混和并完全溶解，再將安瓿內(nèi)的菌懸液全部吸出，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的培養(yǎng)基試管中，根據(jù)菌種類型采用適宜的培養(yǎng)條件（細(xì)菌培養(yǎng)溫度32.52.5，1824小時；真菌培養(yǎng)溫度25.52.5，35天）下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基是否渾濁，（如不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至7天以上，真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至14天以上，仍未渾濁，按相關(guān)規(guī)定滅菌處理。）渾濁說明菌種復(fù)活生長，在應(yīng)用前，還應(yīng)確認(rèn)菌種的純度和特性。菌種確認(rèn) 用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個菌落，適宜條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染

13、色特性及菌形。并作生化實(shí)驗(yàn)或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定該菌種，對已通過確認(rèn)鑒定后的菌種可以使用或傳代保藏。菌種傳代保藏方法很多，各單位了根據(jù)情況采用，但無論應(yīng)用何種方法，都應(yīng)對采用的方法進(jìn)行驗(yàn)證，確保在相應(yīng)保存條件下的菌種不會變異且性能穩(wěn)定，同時也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡便。常用的有甘油冷凍管保藏法、斜面低溫保藏法等，此類方法簡單易行。甘油冷凍管保藏法 將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后（細(xì)菌2448小時的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時的培養(yǎng)物），用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔 ，并通過接踵環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，向已制備好的

14、菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混和，分裝于無菌小管，制好的甘油冷凍管最好在30貯存。斜面低溫保藏法 將工作用菌種的典型菌落接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待菌生長充分以后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種管用牛皮紙包好，轉(zhuǎn)移至4左右冰箱保存，如菌種保藏管的塞子是橡膠塞，并采用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，則可以保存時間較長。銅綠假單胞菌不宜用本法保存。3.1 菌種（1）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003（2）枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501（3）大腸埃希菌(Es

15、cherichia coli)CMCC(B)44102（4）銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104（5）生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941（6）白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001（7）黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)980033.2 菌液制備制備的菌液，一般當(dāng)日使用。取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，32.52.5培養(yǎng)1824小

16、時；白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中見附錄1.3，25.52.5培養(yǎng)2448小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液見附錄3.1制成每毫升含菌小于100菌落形成單位（cfu）的菌懸液。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.52.5培養(yǎng)57天，使大量的孢子成熟，加入35ml0.9%無菌氯化鈉溶液，用玻棒或白金餌輕輕振搖將孢子洗脫。然后，用管口帶有能過濾菌絲的裝置（如薄層無菌棉花或紗布的無菌毛細(xì)吸管）的吸管吸出胞子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液將其稀釋至每毫升含小于100cfu的孢子懸液（可采用比濁法）。以上菌液在供試驗(yàn)的同時，

17、金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌用營養(yǎng)瓊脂，白色念珠菌和黑曲霉用改良馬丁培養(yǎng)基注皿（1ml）或平板涂布（0.1ml），按規(guī)定條件培養(yǎng)后，計數(shù)。4 培養(yǎng)基4.1 一般采用商品脫水培養(yǎng)基，臨用時按照使用說明書進(jìn)行配制，配制培養(yǎng)基時稱量要迅速以免潮濕而影響稱量的準(zhǔn)確性，同時為避免增加培養(yǎng)基中的金屬離子及其他微量化學(xué)元素而影響微生物的生長、鑒別、所用器具應(yīng)為潔凈玻璃器皿，所用溶解用水為純水。4.2 培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必需校正。調(diào)節(jié)pH值：測定pH值的標(biāo)準(zhǔn)溫度為252，調(diào)節(jié)pH值可用無菌的1mol/L（1N）氫氧化鈉或10%碳酸鈉溶液、1mol/L鹽酸溶液或15%冰醋酸

18、溶液。分裝好的培養(yǎng)基及時密封后必須在配制當(dāng)天（2小時內(nèi)最佳）進(jìn)行滅菌處理。4.3 新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)按中國藥典規(guī)定的處方，對培養(yǎng)基的原材料要進(jìn)行挑選，化學(xué)藥品均需用CP試劑規(guī)格。4.3.1 除葡萄糖和指示液外，將處方中各成分加水后置有石棉網(wǎng)的電爐、可調(diào)電磁爐或其它適宜的加熱設(shè)備中，微溫溶解。用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使其比規(guī)定的pH值略高0.40.6，煮沸，用棉（紙）漿減壓抽濾或以脫脂棉，濾紙等濾材過濾，使培養(yǎng)基澄清。4.3.2 加入葡萄糖和指示液，搖勻，補(bǔ)足水量，調(diào)節(jié)pH值（比規(guī)定的pH值略高0.20.4），使滅菌后為7.10.2，分裝，裝量不宜超過容器的2/3，以免滅菌時溢出。

19、4.3.3 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基的氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2，滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100水浴或流通蒸汽加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻。培養(yǎng)基只限加熱一次，并防止被污染。4.3.4 滅菌應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序進(jìn)行。培養(yǎng)基應(yīng)只能進(jìn)行一次蒸汽滅菌處理。固體培養(yǎng)基使用前的融化，不宜使用蒸汽滅菌柜融化瓊脂培養(yǎng)基，宜選用沸水浴融化培養(yǎng)基。4.4 未開封脫水培養(yǎng)基應(yīng)避光儲存于25以下陰涼干燥處，已開封的脫水培養(yǎng)基應(yīng)蓋緊，避光儲存于25以下陰涼干燥處。制備好

20、的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225避光的環(huán)境，有條件置冰箱48冷藏儲存較好。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，應(yīng)在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，可在一年內(nèi)使用。4.5 培養(yǎng)基的裝量4.5.1 對于采用直接接種法檢查的液體樣品，培養(yǎng)基的裝量與供試品的裝量相關(guān)，供試品的裝量小于20ml的樣品，培養(yǎng)基裝量15ml；供試品的裝量大于或等于20ml小于50ml的樣品，培養(yǎng)基裝量40ml；供試品的裝量大于或等于50ml小于100ml的樣品，培養(yǎng)基裝量80ml。4.5.2 對于采用直接接種法檢查的固體樣品（含藥品及外科用輔料棉花及紗布），培養(yǎng)基的裝量均為100ml；對于縫合線、一次性醫(yī)用材料及醫(yī)療器具，如果醫(yī)療器具體積過大

21、，培養(yǎng)基的裝量可在2000ml以上，以將其完全浸沒為準(zhǔn)。4.5.3 對于采用薄膜過濾法檢查的樣品，若用封閉式薄膜濾器操作的，培養(yǎng)基裝量100ml；若用開放式薄膜濾器操作的，培養(yǎng)基裝量50ml。4.6 培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的檢查包括無菌檢查和靈敏度檢查；符合規(guī)定者方可用于供試品的無菌檢查。培養(yǎng)基的無菌檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行，但是，一旦所用培養(yǎng)基不符合無菌要求，供試品的無菌檢查結(jié)果應(yīng)視為無效。培養(yǎng)基的靈敏度檢查應(yīng)對購進(jìn)的每個批號的脫水培養(yǎng)基進(jìn)行靈敏度檢查，檢查合格后方可使用，但當(dāng)培養(yǎng)基的配制方法和滅菌程序發(fā)生變更時，應(yīng)再次對培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行檢查。4.6.1 培

22、養(yǎng)基無菌檢查的操作及結(jié)果判定每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），按規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。4.6.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查的操作及結(jié)果判定取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，每支接種菌量為1ml（含菌小于100cfu），另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接種菌量為1ml（含菌小于100cfu），另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天；逐日觀察結(jié)果?？瞻讓φ展軕?yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。對于配制后

23、的選擇性培養(yǎng)基的靈敏度檢查試驗(yàn)同上。5 方法驗(yàn)證試驗(yàn)為保證檢驗(yàn)質(zhì)量，對所用的檢驗(yàn)方法必須經(jīng)過驗(yàn)證，才能確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。當(dāng)建立藥品的無菌檢查法時，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品在高實(shí)驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計。若供試品的生產(chǎn)工藝，遠(yuǎn)、輔料組分或檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時，檢查方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。針對藥品的無菌檢查試驗(yàn)，在確定產(chǎn)品的無菌檢查試驗(yàn)方法時或建立新的檢查方法時，或當(dāng)試驗(yàn)條件（包括培養(yǎng)條件）發(fā)生變更時，都必須要對新的或變更后的檢驗(yàn)方法加以驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計。確保在實(shí)際檢驗(yàn)條件下，該供試品的無菌檢查法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。驗(yàn)

24、證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作試驗(yàn)。供試品對每一試驗(yàn)菌的抑菌活性應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證用菌種、菌液制備、各試驗(yàn)菌對應(yīng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度、參見3.1及3.1部分。5.1 薄膜過濾法驗(yàn)證試驗(yàn)將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌少于100CFU。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。另取一濾筒，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。5.2 直接接種法驗(yàn)證試驗(yàn)取適量裝置的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭

25、菌的菌液各兩管；取適量裝量的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各兩管。每管加菌量小于100cfu。其中1管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為陽性對照，各試驗(yàn)管按相應(yīng)規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。5.3 判斷與陽性對照比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，并且與陽性對照容器內(nèi)的培養(yǎng)結(jié)果相似，則供試品的該檢驗(yàn)量在檢驗(yàn)條件下無抑菌作用消除，供試品可按該法進(jìn)行無菌檢查。若含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，若采用的是直接接種法，可根據(jù)實(shí)際情況增加培養(yǎng)基的用量、在沖洗液或培養(yǎng)基中使用中和劑（如內(nèi)酰胺酶、對氨基苯甲酸、聚山梨脂80）、或

26、改為薄膜過濾法。若采用的是薄膜過濾法，可采用增加沖洗液的用量、改變沖洗液的種類、更換濾膜品種等方法消除供試品的抑菌作用。并重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。已進(jìn)行過無菌檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，按此法進(jìn)行無菌檢查。6 供試品的無菌檢查6.1 檢驗(yàn)數(shù)量及檢驗(yàn)量檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1規(guī)定，應(yīng)盡量抽取批生產(chǎn)開始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中（見2005年版中國藥典附錄無菌檢查法）最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對照試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽

27、性對照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按藥典附錄無菌檢查法項(xiàng)下表1、表2、表3規(guī)定。采用直接接種法時，若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的總結(jié)婚總量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。6.2培養(yǎng)基用量 除另有規(guī)定外，供試品無菌檢查時，每支培養(yǎng)基的實(shí)際裝量及所占容器高度的比例應(yīng)與“驗(yàn)證試驗(yàn)”所用的培養(yǎng)基相同。6.3陽性對照供試品無菌檢查應(yīng)進(jìn)行陽性對照試驗(yàn)。陽性

28、對照菌的選擇原則：應(yīng)根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果選擇相應(yīng)對照菌（見中國藥典2005年版附錄無菌檢查法），陽性對照管的加菌量的加菌量為小于100個cfu。陽性對照的供試品用量同供試品無菌檢查中每份培養(yǎng)基接種的樣品量按中國藥典2005個年版附錄無菌檢查法項(xiàng)下表2、表3，陽性對照管培養(yǎng)872小時，應(yīng)生長良好。6.4陰性對照凡無菌檢查，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。6.5無菌檢查操作無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。6.5.1供試品在移入緩沖間前應(yīng)除去外包裝、消毒外表面并編號，培養(yǎng)基管（瓶）用0.1新潔爾滅或酒精棉控試瓶（管）外壁，然后

29、連同其他用具（包括無菌衣、帽、口罩等）移入緩沖間，開啟操作間紫外燈和空氣過濾裝置并使其工作1小時以上。6.5.2操作人員用肥皂、水清洗雙手，關(guān)閉紫外光燈，進(jìn)入沖間，換拖鞋，再用75乙醇棉球擦手，穿戴衣、帽、口罩、手套。將所需手品剝?nèi)ヅＦぜ?，移入無菌間，每次試驗(yàn)中所用物品必須計劃好，并有備用物。6.5.3供試品外部消毒6.5.3.1將消毒過的粉針劑、油劑等鋁蓋壓封的橡皮塞小瓶，先用75乙醇或碘伏棉球擦試外壁及瓶塞，待干，用滅菌鑷子剔去鋁蓋上的鋁質(zhì)小圓片，過火焰數(shù)次。6.5.3.2將消毒過的安瓿針劑先用碘酒棉球或伏棉球?qū)碴惩獠坎猎嚋缇?，待干，用砂輪或滅菌銼輕割安瓿頸部（便于拆開安瓶），再用75乙

30、醇棉球?qū)⒌饩撇羶?，待干?.5.3.3其他供試品容器表面或外包裝，可參照上述用適當(dāng)消毒液擦試或浸沒后以無菌的方式取內(nèi)容物。6.5.4供試品制備用滅菌鑷取出器，在火焰旁將針芯插入釧管并安上針頭，供試品瓶蓋和注射器針頭均應(yīng)迅速通過火焰數(shù)次，當(dāng)供試品為粉針劑，瓶蓋為橡膠塞時，用注射器吸取規(guī)定的溶劑，在已消毒好的橡膠塞中心位置刺入小瓶加入溶劑，溶解，混勻后吸出溶液，或選用其它適宜的方法。如為注射液、供角膜創(chuàng)傷及手術(shù)用的滴眼劑或滅菌溶液等可趨勢用注射器吸取藥液，或選用其它適宜的方法。按規(guī)定或需滅活的供試品可用滅活劑溶解，將瓶內(nèi)供試液抽出稀釋至規(guī)定的濃度。需加入空氣加壓后便于抽出的供試品，應(yīng)用器對著火焰抽

31、取空氣加入，抽取瓶中液體時，應(yīng)將供試品倒置并使針頭在液面下。供試品如為直接健壯成注射用無菌粉末的原料藥（大包裝粉針劑），取樣時為縮短暴露時間，應(yīng)由兩人操作。將旋轉(zhuǎn)于緩沖間的包裝瓶用0.1新潔爾滅抹凈外壁，且經(jīng)紫外線照射1小時后移入操作間（臺），除去鋁蓋，用75乙醇棉或碘伏棉球擦拭瓶口橡膠塞外壁和瓶口縫隙，待干，戴好醫(yī)用消毒手套，在火焰旁小心揭開瓶塞，用專用取樣器取出規(guī)定量的樣品，置滅菌試管中，密塞待用，立即蓋好大包裝瓶塞，用橡皮膠布及時封口，再用封箱紙包扎瓶口。如果容器內(nèi)有一定的真空，可用適當(dāng)?shù)臒o菌器材（如一端帶有除菌過濾器的針頭），向供試品容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣，再按無菌操作開啟容器取出內(nèi)容物。

32、供試品處理時所用的溶劑、乳化劑，分散劑，中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證是有效的，并對微生物生長無影響。除另有規(guī)定外，供試品處理及接種，按下更方法進(jìn)行。6.5.5薄膜過濾法無菌檢查用的濾膜孔徑為不大于0.45m，直徑約為50mm。應(yīng)根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)，如抑菌性供試品采用低吸附性的濾膜、油性供試品選用疏水性濾膜。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。同時每片濾膜的總過濾量不宜太大，以避免濾膜上的微生物受損傷。 薄膜過濾法采用封閉式薄膜過濾器或開放式薄膜過濾器，可優(yōu)先選用封閉式薄膜過濾器。如采用封

33、閉式過濾器時，將一次性集菌培養(yǎng)器（依供試品種類不用選擇適宜的集菌培養(yǎng)器如抗生素類采用抗生素專用集菌培養(yǎng)器）放于電控集菌儀的排液槽上，培養(yǎng)器的塑膠軟導(dǎo)管放于電控集菌儀的蠕動泵槽內(nèi)，其進(jìn)液導(dǎo)管的雙芯針頭，插入供試液或沖洗液等容器的塞上。6.5.5.1 操作打開待檢樣品的鋁蓋，復(fù)溶。吸取適量藥液加入0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶液至具塞的瓶中，混勻。如采用封閉式過濾器，取出培養(yǎng)器先檢查包裝是否完好無損，將培養(yǎng)器逐個插放在不銹鋼座上，將培養(yǎng)器的彈性軟管裝入集菌儀泵頭，注意定位準(zhǔn)確，軟管走勢順暢。將培養(yǎng)器導(dǎo)管上的針頭插至供試液容器塞上，開動電控集菌儀電源，將樣品瓶倒置固定于支架上，使藥液均勻通過集

34、菌培養(yǎng)器，待藥液排盡，關(guān)閉電源，將針頭取下，插至裝有適宜沖洗液的瓶塞內(nèi)，沖洗集菌培養(yǎng)器的濾膜，照上述操作要求，沖洗次數(shù)及沖洗量與驗(yàn)證試驗(yàn)保持一致。濾干，關(guān)閉電源。將集菌培養(yǎng)器的排氣孔上膠帽取下，集菌培養(yǎng)器底部的排液管口擰上，將沖洗液瓶取下?lián)Q上相應(yīng)的培養(yǎng)瓶，啟動電源，將培養(yǎng)基泵入指定的培養(yǎng)器內(nèi)，關(guān)閉電源。用小夾夾閉與培養(yǎng)器連接部的軟管，在軟管剪切線的位置剪斷軟管，將軟管開口端套在空氣過濾器開口上。每次操作時，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑、及沖洗液同法操作，作為陰性對照。將已操作完畢的含培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器移出無菌室，取其中一管作為陽性對照，依陽性對照菌選擇原則加入相應(yīng)的對照菌液。按固定溫度與時間培養(yǎng)。大

35、容量非抗菌作用的供試品，薄膜過濾后，無須沖洗。6.5.5.2 注意事項(xiàng)對具有抗菌活性的固體制劑或液體制劑，在過濾膜前，要根據(jù)供試品的抗菌活性的強(qiáng)弱選用適宜、適量的溶劑溶解及稀釋；淋（沖）洗樣品時流速不易過快。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，其總的沖洗量不宜過大，沖洗量及沖洗方法參照方法驗(yàn)證試驗(yàn)。為揮發(fā)濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。無菌試驗(yàn)過程中，若需要使用表面活性劑、滅活劑、中和集等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物生長及存活無影響。6.5.6 直接接種

36、法6.5.6.1 操作 用適當(dāng)滅菌用具，取上述制備妥的供試品在近火焰區(qū)以右手握拳，以小指為主拔開培養(yǎng)基管的塞子，管口通過火焰，移至火焰下側(cè)，沿著培養(yǎng)基管壁分別接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基11管，（其中1管于操作結(jié)束后移至接種室接種金黃色葡萄球菌對照菌液1ml），改良馬丁培養(yǎng)基10管，輕輕搖動使勻，培養(yǎng)14日。每次操作時，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑，同法操作，作為陰性對照。6.5.7 培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長、填寫檢查記錄表。如加入供試品后，或在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14日后，不能從外觀上判斷無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量接種于同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)

37、48小時，真菌培養(yǎng)72小時，觀察是否再現(xiàn)渾濁或斜面上有無菌生長；或用接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，進(jìn)行判斷。6.5.8 結(jié)果判定若供試品管勻澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判斷供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效。（1）無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求：（2）回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（3）陰性對照管有菌生長。（4）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技

38、術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。無菌檢查法附錄1 培養(yǎng)基及其制備方法培養(yǎng)基可按以下處方制備，亦可使用按該處方的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。置備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225、避光的環(huán)境。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，應(yīng)在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，可在一年內(nèi)使用。1.1 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)需氣菌、厭氣菌）酪胨（胰酶水解） 1.50g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5gL胱氨酸 0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸鈉 0

39、.5g 瓊脂 0.50.7g（或硫乙醇酸0.3ml） 水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入說中混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.10.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/3，否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。1.2硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于黏稠供試品的直接接種法）按硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基處方，去除瓊脂和刃天青，取其余成分，如法配制，即得。此培養(yǎng)基應(yīng)在厭氧