蛋白質(zhì)離子交換層析技術(shù)

1、蛋白質(zhì)離子交換層析技術(shù)【Major】2022-04-02 14:47:45 閱讀19 評論0字號(hào)：大中小訂閱摘要：本文介紹了離子交換的根本理論、影響分別純化的因素、常見的離子交換劑和樹脂的處理，以及離子交換層析的根本操作方法。列舉了離子交換層析技術(shù)的一些最應(yīng)用。關(guān)鍵詞：離子交換層析根本理論 樹脂處理 操作方法 應(yīng)用進(jìn)展Protein Ion Exchange Chromatography TechniqueAbstract: Thebasictheoriesofionexchange,factorsthatcan influence the separation and purificatio

2、n of proteins, common ion exchangers, ways of processing the resin and basic operating methodofionexchangechromatographyareintroduced.Somelatest applications of this technique are enumerated.Keywords:Ionexchangechromatography;basictheories;resinprocessing; operating method; advancement of applicatio

3、n近年來，隨著基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)的進(jìn)展，利用細(xì)菌發(fā)酵和動(dòng)植物樣,蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程一般也分為上、中、下游過程。上、中游過程是 運(yùn)用生物技術(shù)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物,下游過程是指對含有目標(biāo)產(chǎn)物的物料進(jìn)展 處理、分別、純化、加工目標(biāo)產(chǎn)物。為了生產(chǎn)高純度、高活性的生物制品，生物工程技術(shù)爭辯經(jīng)費(fèi)的 30需花費(fèi)在分別純化工藝過程的爭辯上，調(diào)查結(jié)果顯示，利用傳統(tǒng)的分別純化技術(shù)純化分別階段的平均生產(chǎn)80。,層析是一門關(guān)鍵技術(shù), 它通常在分別工序的后部,打算著產(chǎn)品的純度和收率。和其它分別技術(shù)相比,層析技術(shù)具有分別效率高、適用性廣和過程易于放大、易于自動(dòng)化的特點(diǎn) ,因而得到了廣泛的應(yīng)用1。本文將對其中的離子交換層析技術(shù)作

4、具體介紹。根本理論離子交換的概念離子交換是利用各帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合理的差異進(jìn)展物質(zhì)分別的操作方法。離子交換的原理氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等大多是兩性物質(zhì)，在水溶液中帶有電荷。由于度不同，這就是離子交換的理論依據(jù)。離子交換現(xiàn)象可用下面的方程式表示：陽離子交換反響：Resin-SO3H+Na+=Resin-SO3 Na + H+ Resin-SO3Na+H+=Resin-SO3 H +陰離子交換反響：Resin-N(CHResin-N(CH3)3OH+Cl-=N(CH3)3 Cl+ OH-1 離子交換過程的機(jī)理A+自溶液中集中到樹脂外表A+從樹脂外表進(jìn)入樹脂內(nèi)部的活性中心A+與RB 在活性中

5、心上發(fā)生復(fù)分解反響解吸附離子B+自樹脂內(nèi)部集中至樹脂外表B+離子從樹脂外表集中到溶液中部集中把握Resin-N(CHResin-N(CH3)3 Cl+OH-=N(CH3)3 OH+Cl-1.3 離子交換的分類1.3.1 分類 exchange)含酸性基團(tuán)和陰離子交換樹脂(anion exchange)含堿性基團(tuán)。具體又可以分為：強(qiáng)陽、弱陽和強(qiáng)陰、弱陰。次甲基磺酸基； -COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基團(tuán)；強(qiáng)堿性陰離子交換劑：活性基團(tuán)為季銨基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基-羥基乙基胺基；弱堿性陰離子交換劑：活性基團(tuán)為伯胺或仲胺，堿性較弱；pH pH 范圍pH pH 范圍小。1.3.2

6、常見離子交換樹脂的鑒定在樹枝的使用過程中，由于保管不善或其他的偶然因素，馬上樹脂搞 混。而各類樹脂的外形和顏色又無統(tǒng)一的規(guī)定，故單從外觀很難識(shí)別陰陽。彥文斌等建立了簡便的方法，利用CuSO4、HCl、NaOH、NH3.H2O、酚酞和甲基紅等試劑鑒定四類常見樹脂2。22 常見離子交換樹脂的鑒定常用的離子交換劑離子交換樹脂離子交換樹脂是一種在交聯(lián)聚合物構(gòu)造中含有離子交換基團(tuán)的功能高 分子材料。離子交換樹脂不溶于酸、堿溶液及各種有機(jī)溶劑 ,構(gòu)造上屬于既不溶解、也不熔融的多孔性固體高分子物質(zhì)。每個(gè)樹脂顆粒都由交聯(lián)的具有三維空間立體構(gòu)造的網(wǎng)絡(luò)骨架構(gòu)成,在骨架上連接著很多較為 活潑的功能基。這種功能基能離

7、解出離子,可以與四周外邊離子相互交 換。離子交換樹脂的單元構(gòu)造由三局部組成:不溶性的三維空間網(wǎng)狀骨 3。離子交換纖維素構(gòu)造以及較大的外表積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子如蛋白質(zhì)的交換容量比離子交換樹脂大。特點(diǎn)：骨架松散、親水性強(qiáng)、外表積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫存、區(qū)分率高常用的離子交換纖維素有：甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素CMC、二乙基氨基乙基纖維素DEAE離子交換葡聚糖離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空 間網(wǎng)狀構(gòu)造和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物，如sepharose、sephadex。特點(diǎn)：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了

8、分別的效率。目前,商品化的離子交換層析介質(zhì)品種很多4。影響交換速度的因素離子交換速度的影響因素很多，綜合起來主要有以下幾個(gè)方面：顆粒大?。河≡娇旖宦?lián)度：交聯(lián)度小，交換速度快溫度：越高越快離子化合價(jià)：化合價(jià)與高，交換越快離子大小：越小越快攪拌速度：在肯定程度上，越大越快溶液濃度：當(dāng)交換速度為外集中把握時(shí)，濃度越大，交換速度越快影響離子交換選擇性的因素水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；離子化合價(jià)：高價(jià)離子易于被吸附；溶液pH：影響交換基團(tuán)和交換離子的解離程度，但不影響交換容量；離子強(qiáng)度：越低越好；有機(jī)溶劑：不利于吸附；交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分力量增大 ；交聯(lián)度小，膨脹度

9、大，吸附量削減；樹脂與粒子間的關(guān)心力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等關(guān)心力；離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型處理由于樹脂在生產(chǎn)和運(yùn)輸途中會(huì)引入一些中間體和一些雜質(zhì) ,所以應(yīng)用前要處理。首先要去雜、過篩，粒度過大時(shí)可稍加粉碎，對于粉碎后或用蒸去除殘存的少量有機(jī)雜質(zhì)后,再用約 1mol/L 的NaOH 1mol/L HCl 反復(fù)沖洗?？捎檬稑渲康囊后w,3 次,每次酸和堿處理轉(zhuǎn)換時(shí)用水洗至中性,最終用水洗至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可 使用或裝柱5。再生樹脂可以重復(fù)使用,使用其吸附有效成分后 ,將有效成分洗脫下來,可以再利用,需要用酸堿轉(zhuǎn)型,用水洗至中性,但是用的次數(shù)多了,會(huì)有一些雜質(zhì)在上面影響效率

10、,需要徹底再生或換樹脂,一般樹脂可以使用 20 次:(陰樹脂),(陽樹脂),也可以用飽和鹽水浸泡。動(dòng)態(tài)再生方法比一般再生方法優(yōu)越。被鐵離子污染的陰離子交換樹脂用亞硫酸鈉去除較徹底。5脂的體外電再生工藝,使離子交換水處理變?yōu)橐环N綠色環(huán)保水處理技術(shù)6。轉(zhuǎn)型過程。對于弱酸或弱堿型樹脂須用堿 NaOH或酸HCl轉(zhuǎn)型，對于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿型樹脂除使用酸堿外還可以用相應(yīng)的鹽溶液轉(zhuǎn)型。總之，對離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型的目的是全都的，即要求其帶上使用時(shí)所期望的離子或基團(tuán)。離子交換層析根本操作方法樹脂的選擇的一條是依據(jù)分別要求和分別環(huán)境保證分別目的物與主要雜質(zhì)對樹脂 的吸附力有足夠的差異。一般而言：酸性物質(zhì)用陰離

11、子交換劑分別，堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分別，氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)， 可依據(jù)其pI 值及離子化曲線來選擇。，這樣有助于提高選擇性并便于洗脫。如目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物 對于大多數(shù)蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子的分別多承受弱酸或弱堿性樹脂，以削減生物大分子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。層析柱離子交換層析要依據(jù)分別的樣品量選擇適宜的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1：101：50 之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時(shí)要均勻平坦，不能有氣泡。裝柱先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，用玻璃棒擠壓海綿，趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將交換劑用起始緩沖液調(diào)稀攪勻后參加，柱內(nèi)的

12、交換劑應(yīng)格外均勻地分布，不應(yīng)消滅節(jié)面和氣泡，不能干柱，床面要平坦，床高距柱頂23cm 為宜。平衡緩沖液沖液的離子強(qiáng)度和pH 值的選擇首先要保證各個(gè)待分別物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是要使各個(gè)待分別物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量合或結(jié)合不穩(wěn)定。上樣離子交換層析的上樣時(shí)應(yīng)留意樣品液的離子強(qiáng)度和pH 值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1%-5%(體積分?jǐn)?shù))為宜，以使樣品能吸附在 層析柱的上層，得到較好的分別效果。將柱中的緩沖液漸漸放出，使頂參加酶樣，待樣液達(dá)肯定高度后再在柱中間留神加樣。待樣母剛好全部進(jìn)入床內(nèi)后用足夠量的起始緩沖液流過層析柱，洗出未被吸附的物質(zhì)。洗脫緩沖液在離子交換層析中一般常

13、用梯度洗脫，通常有轉(zhuǎn)變離子強(qiáng)度和轉(zhuǎn)變 pH 值兩種方式。轉(zhuǎn)變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來；而轉(zhuǎn)變pH 值的洗脫， 對于陽離子交換劑一般是 pH 值從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH pH 值可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常承受轉(zhuǎn)變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。洗脫速度定。一般來說洗脫速度慢比快的區(qū)分率要好，但洗脫速度過慢會(huì)造成分別時(shí)間長、樣品集中、譜峰變寬、區(qū)分率降低等副作用，所以要依據(jù)實(shí)際狀況選擇適宜的洗脫速度。假設(shè)洗脫峰相對集中某個(gè)區(qū)域造成重疊， 則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高區(qū)分率；假設(shè)區(qū)分率較 好，但洗脫峰過寬，則可

14、適當(dāng)提高洗脫速度。樣品的濃縮、脫鹽離子交換層析得到的樣品往往鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，而且體積較大，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進(jìn)展?jié)饪s、脫鹽處理。另外在層析分別過程中還要留意操作手段和溶液環(huán)境，如溫度、壓力和緩沖系統(tǒng)對欲分別物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，避開被分別物質(zhì)失活7。應(yīng)用進(jìn)展離子交換樹脂不溶于一般的酸、堿溶液及很多有機(jī)溶劑。它以交換、選擇、吸取和催化等功能來實(shí)現(xiàn)除鹽、分別、精制、脫色和催化等應(yīng)用效果。它廣泛應(yīng)用于電力、化工、冶金、醫(yī)藥、食品和原子能等部門 ,主要是制取軟水和純水三廢處理及分別精制藥品等8。9爭辯了絲膠蛋白質(zhì)對陰離子交換纖維的吸附性能以及從陰離子交換纖10離子交換層析

15、法對玉米蛋白酶解液進(jìn)展了分別純化，得到降血壓肽并爭辯了離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度梯度以及上樣量對分別效果的影響,得到最正確分別條件。11以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，三聚異氰尿酸三烯丙酯和二乙烯基苯為交聯(lián)劑，甲苯和正庚烷為有機(jī)致孔劑，用原位聚合的方法合成親水性高分子載體。胺化反響劑的制備及性能爭辯。在此根底上，承受固體顆粒與有機(jī)溶劑聯(lián)合致孔模式，以硫酸鈉顆粒為固體致孔劑，制備型雙孔離子交換劑并比較了兩種樹脂的孔構(gòu)造及其對牛血清白蛋白的吸附行為。12 爭辯了利用批量離子交換層析與凝膠過濾層析相結(jié)合的方法純化類人 膠原蛋白I pH、離子強(qiáng)度、進(jìn)料蛋白濃度對批量離子交換的影響，以及不同凝膠過濾介13以離子交

16、換層析和凝膠過濾成功地從鹽源山蛭頭局部別純化了抗凝血多肽。參考文獻(xiàn)鮑時(shí)翔,姚汝華. 蛋白質(zhì)分別純化與層析技術(shù)進(jìn)展J. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1996,24(12):98-102.常見離子交換樹脂的鑒定J.自然科學(xué),1993,6(14):85-87梁志冉,涂勇,田愛軍等. 離子交換樹脂及其在廢水處理中的應(yīng)用J.污染防治技術(shù),2022,3(19):34-36浦宇,王芝祥. 蛋白質(zhì)層析用離子交換和疏水作用層析介質(zhì)的進(jìn)展概況J. 生物工程學(xué)報(bào),2022,6(20):975-981劉喜綱,劉翠哲,王棟. 離子交換樹脂在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 J. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2022,3(21):243-244王方.離子交換樹脂的綠色再生工藝J.工業(yè)水處理,2022,12(25):5-8李明,Jan-Christer Janson,蘇志國. 蛋白質(zhì)在層析過程中的失活與復(fù)性J.化工學(xué)報(bào),2022.7(15):1033-1040呂儀軍.離子交換樹脂應(yīng)用進(jìn)展J. 四川化工與腐蝕把握,2022,6(2):36-37府靜燕, 閔潔.絲膠蛋白質(zhì)離子交換回收方法的爭辯J. 絲綢,202