β細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致PC12細(xì)胞損傷的愛惜作用

1、- 細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致 PC12細(xì)胞損傷的愛惜作用陳奕芝 , 方永奇 , 梁 毅, 王綺雯 , 何玉萍【摘要】 目的 研究 - 細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞損傷的愛惜作用 , 并探討其作用機(jī)理。方式 用谷氨酸造成 PC12細(xì)胞損傷模型, 觀看 - 細(xì)辛醚對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、損傷程度、存活力、鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡的阻礙。結(jié)果 10 mmol/L 谷氨酸作用 PC12細(xì)胞 16 h, 顯現(xiàn)明顯損傷 , 凋亡率和死亡率升高 , 培育上清液中 LDH含量增加；、1 五、30g/mL- 細(xì)辛醚可有效改善谷氨酸損傷引發(fā)的 PC12 細(xì)胞形態(tài)改變 , 提高細(xì)胞存活力 , 減少乳酸脫氫酶滲漏； 1 五、30

2、 g/mL - 細(xì)辛醚能明顯降低谷氨酸引發(fā)的 PC12 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡率。結(jié)論- 細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致 PC12 細(xì)胞損傷具有愛惜作用 , 其作用機(jī)制可能與鈣拮抗作用有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】 PC12 細(xì)胞；谷氨酸；鈣； - 細(xì)辛醚Abstract ：ObjectiveTo study the protectiveeffectsof-asarone on PC12cellsdamageinduced by Glutamate.Method Theeffectsof -asaroneonPC12cellsafterGlutamateintoxication on morphology, ext

3、ent of damage, livability, intracellular calcium concentration and apoptosis ratio wereobserved.ResultMorphologicalchanges,LDH leakageandintracellular calcium concentration increasing, and cell survival decreasing were observed in PC12 cells exposured toGlutamate., 15, 30g/mL-asaronecan increasecell

4、survival,decrease LDH leakage. intracellular calcium15,30 g/mLconcentration -asarone can and apoptosisreduceratio.Conclusion -asarone prevents the toxicity of Glutamate, and it maybe attribute to its effect of anticalcium.Key words ：PC12 cells ；Glutamate ；Ca2+； -asarone本實(shí)驗(yàn)采納體外培育PC12 細(xì)胞方式 , 用谷氨酸 (Glu

5、) 造成損傷模型 , 觀看 - 細(xì)辛醚對(duì)PC12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)活性、細(xì)胞內(nèi)游離鈣和細(xì)胞凋亡率的阻礙。實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞、藥物和試劑高分化 PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。Glu為 Amresco 產(chǎn)品；高糖 DMEM粉劑培育基、胎牛血清、馬血清、 %胰酶均為 GIBCO產(chǎn)品；噻唑藍(lán) (MTT)為 Sigma公司產(chǎn)品；磷酸緩沖液 (PBS)、二甲基亞砜 (DMSO)為北京鼎國產(chǎn)品； Annexin v-FITC 試劑盒購自晶美生物工程； Fluo-3/AM 為 Biotium Inc 產(chǎn)品；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 細(xì)胞培育板為 CORNIN

6、G產(chǎn)品。- 細(xì)辛醚的制備由本中心完成 , 純度 %。臨用前稱取適量 - 細(xì)辛醚與吐溫 -80 及甘油 , 以 111 充分混勻后加滅菌雙蒸水配成終濃度為10 mg/mL- 細(xì)辛醚溶液 ,歷時(shí)培育基稀釋至所需終濃度。要緊儀器設(shè)備CO2 培育箱 (NUAIK)；倒置相差顯微鏡 (OLYMPUS)； BIO-RAD550型酶標(biāo)儀； ALTRAEPICS流式細(xì)胞儀 (BECKMANCOULTER)；6010 紫外可見分光光度計(jì) ( 惠普上海分析儀器 ) 。實(shí)驗(yàn)方式造模蘇醒后的 PC12細(xì)胞接種于 25 cm2 培育瓶中 , 培育液為含 5% 馬血清、 5%胎牛血清的 DMEM高糖培育基 ,37 、 5

7、% C02培育箱中培育。待細(xì)胞長滿單層 ,%胰酶消化 , 用含血清的 DMEM培育基終止消化并調(diào)細(xì)胞密度為 5104 個(gè)/mL, 接種在 96 孔培育板 ( 棄去周圍邊孔 ), 每孔 100 L, 周圍邊孔每孔加入等體積 PBS溶液 , 待細(xì)胞貼壁生長交叉成網(wǎng)后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、 Glu mmol/L) 損傷組 , 繼續(xù)培育 16 h 后觀看細(xì)胞形態(tài)改變 , 并用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。藥物愛惜實(shí)驗(yàn)PC12細(xì)胞接種于 96 孔( 每孔 100 L) 及 24 孔培育板 ( 每孔 1 mL), 培育條件同上 , 待細(xì)胞鋪滿單層 , 吸棄原培育基 , 用 PBS液洗 1 次,隨機(jī)分為

8、6 組。正常對(duì)照組和 Glu 損傷組加入無血清培育基 , 陽性對(duì)照組加入終濃度為 10 mol/L 尼莫地平 , - 細(xì)辛醚設(shè) 3 個(gè)劑量組 , 別離為、 1 五、30 g/mL, 培育 4 h 后, 除正常對(duì)照組外 , 其余各組蕩洗后加入終濃度為 10 mmol/L 的 Glu 繼續(xù)培育 16 h, 用于各指標(biāo)檢測(cè)。觀看指標(biāo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀看、存活力(MTT 法) 、培育上清液LDH活性 ( 比色法) 、凋亡率和胞內(nèi)鈣離子濃度 ( 流式細(xì)胞儀熒光染色法 ) 。統(tǒng)計(jì)學(xué)方式數(shù)據(jù)以 xs 表示 , 采納 SPSS 軟件包分析 , 組間比較采納單因素方差分析。3 結(jié)果谷氨酸對(duì) PC12細(xì)胞的損傷作用PC

9、12細(xì)胞培育 2 h 后完全貼壁 , 呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài) , 圓形 , 折光性較強(qiáng) , 生長速度快 ,2 d后生長成網(wǎng)狀。 PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度Glu作用 16 h 后, mmol/L Glu 對(duì) PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力沒有明顯轉(zhuǎn)變 , 而 mmol/L Glu 那么對(duì) PC12細(xì)胞有不同程度的損傷 , 表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮 , 部份貼壁不良、脫落 , 裂解成碎片 , 折光度下降 , 細(xì)胞活力也明顯下降 , 且呈劑量依托關(guān)系 , 故本實(shí)驗(yàn)選用 10 mmol/L Glu 為造模濃度 ( 見表 1) 。尼莫地平及 - 細(xì)辛醚預(yù)孵育 4 h, 其細(xì)胞形態(tài)無明顯轉(zhuǎn)變。表 1 不同濃度 Glu

10、對(duì) PC12細(xì)胞活力的阻礙 ( 略) 注：與正常對(duì)照組比較 ,*P 。- 細(xì)辛醚對(duì)造模 PC12細(xì)胞活力、谷氨酸的阻礙( 見表 2) 表 2 - 細(xì)辛醚對(duì)造模 PC12細(xì)胞活力和 LDH的阻礙（略）注：與正常對(duì)照組比較 ,*P ,*P ；與 Glu 組比較 ,P, P( 下同 ) 。- 細(xì)辛醚對(duì)造模 PC12細(xì)胞凋亡率、胞漿游離鈣的阻礙( 見表 3) 表 3 - 細(xì)辛醚對(duì)造模 PC12細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的阻礙 ( 略)討論P(yáng)C12 細(xì)胞株來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞, 生長迅速、穩(wěn)固 , 不易發(fā)生自動(dòng)轉(zhuǎn)化 , 可成立能傳代的二倍體細(xì)胞系 1 。其細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能皆類似于神經(jīng)細(xì)胞

11、 , 成為最近幾年來研究神經(jīng)細(xì)胞遞質(zhì)合成、貯存和釋放、離子通道規(guī)律及受體的細(xì)胞模型 2 。Glu 是一種中樞興奮性氨基酸遞質(zhì), 過量的 Glu 可促使突觸前過量的蛋白激酶C(PKC)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移并活化 , 從而過度激活突觸后膜的 Glu 受體 NMDA受體 , 促使 Ca2+內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度上升又可激活細(xì)胞內(nèi)的硫蛋白酶 (calpin-I), 引發(fā)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白 -fordrin 降解, 使膜上 Glu 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量明顯增加 , 致使胞內(nèi) Ca2+超載 , 顯現(xiàn)遲發(fā)性損害 3 。本實(shí)驗(yàn)用 Glu 造成 PC12細(xì)胞損傷 , 通過觀看和檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活力、 LDH 釋放量和細(xì)胞

12、凋亡和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的轉(zhuǎn)變, 探討 - 細(xì)辛醚對(duì) PC12細(xì)胞 Glu 損傷的愛惜作用及其作用機(jī)理。本研究結(jié)果說明 ,PC12 細(xì)胞受到 Glu 損傷后 , 細(xì)胞存活率降低、 LDH 漏出率升高、細(xì)胞凋亡率和死亡率升高、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高；- 細(xì)辛醚能提高細(xì)胞存活率、 降低 LDH漏出率、抑制細(xì)胞凋亡和死亡、降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。 - 細(xì)辛醚與 PC12細(xì)胞預(yù)溫育 4 h, 可選擇性降低 Glu 引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度的異樣升高 , 抑制細(xì)胞凋亡 , 這可能是 - 細(xì)辛醚能特異性且劑量依托性地抑制 Glu 與其受體相結(jié)合 , 從而抑制受體門控鈣通道的開放 , 減少胞外游離鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) , 減輕 Glu 的興奮性毒性有關(guān) , 從分子水平上初步說明了 - 細(xì)辛醚對(duì)興奮性神經(jīng)毒的愛惜作用機(jī)制。興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用老是伴隨著鈣超載現(xiàn)象 , 筆者以為 , - 細(xì)辛醚對(duì) Glu 引發(fā)的 PC12細(xì)胞損傷的愛惜作用可能與其鈣拮抗作用有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】張均田 , 張慶柱 . 神經(jīng)藥理學(xué)研究技術(shù)與方式 M. 第 2 版. 北京：人民衛(wèi)生出版社 ,.Shafter TJ, Atchison WD. Transmitter, ion channelandreceptorpropertiesofPC12cells： amodelforneurotoxicologicals