自殺基因聯(lián)合中藥治療腫瘤詳解演示文稿

1、自殺基因聯(lián)合中藥治療腫瘤詳解演示文稿第一頁，共七十四頁。（優(yōu)選）自殺基因聯(lián)合中藥治療腫瘤第二頁，共七十四頁。內(nèi) 容 研究背景及研究思路HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建中藥方藥對腫瘤自殺基因治療的增效作用中藥方藥增效作用的機制腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的改進工作第三頁，共七十四頁。研究背景及研究思路第四頁，共七十四頁?；蛑委煹母拍罨蛑委熅褪菍⑼庠葱曰?qū)氲秸；虿∽兗毎?，利用其轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的一種方法第五頁，共七十四頁?；蛑委煹牟呗缘诹?，共七十四頁?；蛑委煹呐R床試驗第七頁，共七十四頁。腫瘤的基因治療惡性腫瘤由于患者來源廣，用于治療的基因多，容易復(fù)制動物模型等原因

2、而成為首選對象 第八頁，共七十四頁。目前常用的腫瘤基因治療方案 腫瘤的免疫基因治療腫瘤抑制基因治療 自殺基因治療（最有應(yīng)用前景） 腫瘤多藥耐藥性基因治療 抑制血管生成的基因治療第九頁，共七十四頁。自殺基因的概念 所謂自殺基因是指在一定條件下，可以引起細胞自動死亡的基因 目前研究的多數(shù)自殺基因是通過編碼病毒或細菌的酶介導(dǎo)敏感性，這些酶能把藥物的無活性形式轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，引起細胞死亡第十頁，共七十四頁?；蛎Q底物產(chǎn)物旁殺傷效應(yīng)備注單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷類似物磷酸化的核苷類似物有研究最多已上臨床水痘帶狀皰疹病毒胸苷

3、激酶（VZV-tk）araMaraATP大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（EC-CD）5-FC5-FU有已上臨床大腸桿菌硝基還原酶（NTR）CB1954，MTZ，NFT羥胺衍生物有研究正在興起大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（EC-XGPRT或gpt基因）6TG6TX6-硫代鳥嘌呤酸有細胞色素P450 CYP 2B1CPA，IFA堿性化的底物有細胞羧肽酶G2（CPG2）CMDA芥類藥物有大腸桿菌DeoD 基因（PNP）Mep-dr6-甲嘌呤有白細胞介素1轉(zhuǎn)化酶（ICE）RARP，Lamins Rb，U1-70kD等被降解失活的底物p53有目前應(yīng)用于實驗室和臨床主要的自殺基因治療系統(tǒng) 第十一頁，共七十四

4、頁。自殺基因治療的優(yōu)勢特異性殺傷基因表達細胞殺傷多藥耐藥性（MDR）腫瘤細胞基因的表達只需將一定量的前藥轉(zhuǎn)換成足以殺傷腫瘤細胞的劑量即可，而無需基因的長期表達絕大部分自殺基因存在極明顯的“旁殺傷效應(yīng)”，體外只需有10以上的腫瘤細胞表達自殺基因，就可以殺傷絕大部分甚至全部腫瘤細胞良好的瘤苗 第十二頁，共七十四頁。旁殺傷效應(yīng) 第十三頁，共七十四頁。旁殺傷效應(yīng)作用機制 “縫隙連接”機制 免疫介導(dǎo)機制 “細胞凋亡”機制 介質(zhì)機制 抗腫瘤血管生成 第十四頁，共七十四頁?？p隙連接機制第十五頁，共七十四頁。免疫介導(dǎo)機制tk+死亡大量抗原釋放免疫細胞浸潤細胞因子釋放免疫炎癥系統(tǒng)介導(dǎo)的非特異性殺傷誘發(fā)特異性抗腫

5、瘤免疫反應(yīng)12免疫抑制免疫激活免疫增強旁殺傷效應(yīng)增強死亡第十六頁，共七十四頁。“細胞凋亡”機制自殺基因引起細胞死亡的形式為細胞凋亡tk+細胞凋亡形成凋亡小體為tk-細胞吞噬引起tk-細胞死亡細胞死亡tk-細胞第十七頁，共七十四頁。介質(zhì)擴散 CD5-Fc5-Fu5-Fu5-Fu5-FuCD-細胞死亡第十八頁，共七十四頁?？鼓[瘤血管生成注： 自殺基因第十九頁，共七十四頁。單純自殺基因治療存在主要問題目的基因轉(zhuǎn)染率低而殺傷力不足；缺乏靶向性，自殺基因的表達缺乏組織特異性和時序性等，單純自殺基因治療難以完全消除腫瘤細胞第二十頁，共七十四頁。腫瘤自殺基因療法的增效方法 雙自殺基因治療 聯(lián)合治療 聯(lián)合免疫

6、基因治療 聯(lián)合放射治療 聯(lián)合化學治療 聯(lián)合其他基因 靶向基因治療 增強旁殺傷效應(yīng) 第二十一頁，共七十四頁。單純自殺基因治療易復(fù)發(fā)聯(lián)合治療增效聯(lián)合免疫基因 聯(lián)合放化療多基因間互相干擾，難以保證導(dǎo)入基因表達或長期表達；使用病毒載體量增多，潛在毒副作用增大；操作過程復(fù)雜，成本較高聯(lián)合中藥方藥載體轉(zhuǎn)染效率低靶向性不夠自殺基因療法聯(lián)合中藥方藥可能是一種更為有效和可行的方案研究思路增強免疫功能增強“縫隙連接”功能增強殺傷敏感性提高旁殺傷效應(yīng) 肯定的免疫藥理作用 多靶點作用 給藥方便，價格低廉，毒副作用小或無明顯毒副作用第二十二頁，共七十四頁。HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建 第二十三頁，共七

7、十四頁。技術(shù)路線獲得目的基因酶切酶切鑒定質(zhì)粒重組病毒包裝和陽性克隆篩選病毒感染胃癌細胞重組質(zhì)粒鑒定病毒滴度測定GCV殺傷試驗斑點雜交鑒定第二十四頁，共七十四頁。目的基因（tk基因）的獲得 由美國匹茲堡大學藥理教研室Huang L.教授惠贈，廣州軍區(qū)總醫(yī)院趙亞剛博士提供 （ pICl9R/MCl-tk質(zhì)粒）第二十五頁，共七十四頁。pICl9R/MCl-tk質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 1 2 3 4 5a：pICl9R/MCl-tk質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖 b：pICl9R/MCl-tk質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖譜 注（b）：1：Marker(DNA Hind)； 2：pICl9R/MCl-tk質(zhì)粒 3：pICl9R/MCl-

8、tk質(zhì)粒/BamH； 4：pICl9R/MCl-tk質(zhì)粒/BamH+EcoR 5：Marker(DNA /EcoR+ Hind) 第二十六頁，共七十四頁。重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶鑒定結(jié)果 a：pLXSN-tk質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖b：pLXSN-tk質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖譜1 2 3 4 5 61DNA marker (分子量分別為2.5kb, 2.0kb , 1.5kb , 1.0 kb, 500bp, 300bp)2pLXSN-tk經(jīng)EcoR I單酶切34pLXSN-tk經(jīng)EcoR I/BamH I雙酶切5 pLXSN-tk質(zhì)粒6 DNA/ EcoR I/Hind marker 第二十七頁，共七十四頁。重

9、組質(zhì)粒的測序圖鑒定結(jié)果 第二十八頁，共七十四頁。PT67包裝細胞篩選結(jié)果 a：G418篩選5d后的PT67 b：篩選2w后形成的陽性克隆細胞圖3 pLXSN-tk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細胞PT67結(jié)果第二十九頁，共七十四頁。病毒滴度測定及結(jié)果 本實驗測定滴度最高為1104cfu/mL第三十頁，共七十四頁。胃癌細胞tk基因的斑點雜交鑒定 1 2 3 胃癌細胞SGC-7901、SGC-7901/tk的 DNA與tk探針的斑點雜交圖 注：1. pLXSN/ tk 質(zhì)粒DNA（陽性對照）； 2. SGC-7901細胞DNA； 3. SGC-7901/tk細胞DNA 第三十一頁，共七十四頁。GCV對人胃癌細胞SG

10、C-7901的體外殺傷試驗 第三十二頁，共七十四頁。結(jié)論及意義已成功已成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng) HSV- tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)成功的構(gòu)建，為后續(xù)的研究工作奠定了堅實的基礎(chǔ) 第三十三頁，共七十四頁。中藥方藥對腫瘤自殺基因治療的增效作用第三十四頁，共七十四頁。動物水平實驗第三十五頁，共七十四頁。技術(shù)路線H22/tk和H22/tk按14混合接種小鼠皮下組織（ 2106細胞 ）病毒感染肝癌細胞療效觀察動物分組GCV體外殺傷試驗成瘤后治療小鼠移植性肝細胞癌治療實驗(六味地黃) 第三十六頁，共七十四頁。分組及治療 模型對照組正常對照組聯(lián)合治療組 六味地

11、黃丸治療組 自殺基因治療組 （造模）第2天第6天第16天蒸餾水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理鹽水每天0.25mL 蒸餾水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理鹽水每天0.25mL 腹腔注射生理鹽水每天0.25mL 腹腔注射GCV100mgkg-1d-1 腹腔注射GCV100mgkg-1d-1六味地黃丸懸液灌胃10gkg-1d-1 蒸餾水灌胃每天0.5mL 六味地黃丸懸液灌胃10gkg-1d-1（造模）（造模）（造模）（生理鹽水）第三十七頁，共七十四頁。腫瘤生長體積曲線時間（d）第三十八頁，共七十四頁。腫瘤質(zhì)量及抑瘤率組別n腫瘤質(zhì)量（g）抑瘤率（%）模型對照組191.58251.2380六味地黃治療

12、組190.84980.716346.3自殺基因治療組200.99040.979637.4聯(lián)合治療組180.58590.3786*63.0注：*與模型對照組比較P0.05抑瘤率=（模型組腫瘤質(zhì)量治療組腫瘤質(zhì)量）/模型組腫瘤質(zhì)量100% 第三十九頁，共七十四頁。腫瘤質(zhì)量圖示第四十頁，共七十四頁。病理檢查結(jié)果(肉眼觀察) 注：第二組：腫瘤模型組；第三組：六味地黃丸治療組；第四組：自殺基因治療組； 第五組：聯(lián)合治療組 第四十一頁，共七十四頁。病理檢查結(jié)果(光鏡觀察 ) 模型對照組 腫瘤細胞數(shù)量較多，密集。六味地黃丸治療組 腫瘤細胞數(shù)量較多，密集。自殺基因治療組 腫瘤細胞數(shù)量密度相對較少。 聯(lián)合治療組

13、腫瘤細胞數(shù)量密度相對較低。 各組細胞密度第四十二頁，共七十四頁。模型對照組：腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結(jié)構(gòu)的壞死組織 六味地黃丸治療組：腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結(jié)構(gòu)的壞死組織 自殺基因治療組：腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結(jié)構(gòu)的壞死組織 聯(lián)合治療組：腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結(jié)構(gòu)的壞死組織。各組腫瘤壞死情況第四十三頁，共七十四頁。模型對照組：腫瘤周邊纖維組織增生不明顯，未見明顯包膜 六味地黃丸治療組：腫瘤周邊纖維組織增生較明顯，形成較明顯的假包膜 自殺基因治療組：腫瘤周邊纖維組織增生較明顯，形

14、成較明顯的假包膜 聯(lián)合治療組：腫瘤周邊纖維組織增生較明顯，形成較厚的假包膜 各組腫瘤纖維結(jié)締組織增生情況第四十四頁，共七十四頁。模型對照組：腫瘤邊緣見少量炎細胞浸潤 六味地黃丸治療組：腫瘤邊緣纖維結(jié)締組織內(nèi)見較多量炎細胞浸潤 自殺基因治療組：腫瘤邊緣纖維結(jié)締組織內(nèi)見較多量炎細胞浸潤 聯(lián)合治療組：腫瘤邊緣纖維結(jié)締組織內(nèi)見大量炎細胞浸潤 各組腫瘤組織炎細胞浸潤情況第四十五頁，共七十四頁。肝癌治療實驗結(jié)論 自殺基因療法與六味地黃丸聯(lián)合應(yīng)用于小鼠移植性肝細胞癌的治療具有協(xié)同效應(yīng)，表明六味地黃丸對自殺基因治療小鼠移植性肝細胞癌具有增效作用 第四十六頁，共七十四頁。丹參注射液H22肝癌荷瘤小鼠剝落瘤塊照片

15、A 模型對照組； B 丹參組；C tk/GCV組； D 聯(lián)合組.第四十七頁，共七十四頁。技術(shù)路線tk和tk細胞按14混合接種小鼠皮下組織（ 1106細胞 ）病毒感染黑色素瘤細胞療效觀察動物分組及治療GCV體外殺傷試驗小鼠移植性黑色素瘤治療實驗 第四十八頁，共七十四頁。分組及治療 模型對照組正常對照組聯(lián)合治療組 六味地黃丸治療組 自殺基因治療組 （造模）第2天第7天第27天蒸餾水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理鹽水每天0.25mL 蒸餾水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理鹽水每天0.25mL 腹腔注射生理鹽水每天0.25mL 腹腔注射GCV100mgkg-1d-1 腹腔注射GCV100mgkg-1

16、d-1六味地黃丸懸液灌胃10gkg-1d-1 蒸餾水灌胃每天0.5mL 六味地黃丸懸液灌胃10gkg-1d-1（造模）（造模）（造模）（生理鹽水）第四十九頁，共七十四頁。成瘤時間接種模型對照組 六味地黃丸治療組 自殺基因治療組 聯(lián)合治療組 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30第五十頁，共七十四頁。成瘤率第五十一頁，共七十四頁。腫瘤生長體積曲線時間（d）時間（d）第五十二頁，共七十四頁。腫瘤質(zhì)量及抑瘤率注：*與模型對照組比較 P0.05 六味地黃治療組因有2只腫瘤較大的荷瘤小鼠后期死亡未能獲得腫瘤標本，該數(shù)據(jù)低于實際數(shù)據(jù) 抑瘤率=（模型組腫瘤質(zhì)量治療組

17、腫瘤質(zhì)量）/模型組腫瘤質(zhì)量100% 組別n腫瘤質(zhì)量（g）抑瘤率（%）模型對照組100.95831.3260自殺基因治療組110.35660.856962.8六味地黃治療組70.43690.693754.4聯(lián)合治療組100.12340.2538*87.1第五十三頁，共七十四頁。各組腫瘤質(zhì)量圖示注：六味地黃治療組因有2只腫瘤較大的荷瘤小鼠后期死亡未能獲得腫瘤標本，該數(shù)據(jù)低于實際數(shù)據(jù)第五十四頁，共七十四頁。病理檢查結(jié)果(肉眼觀察) 注：B：腫瘤模型組；C：自殺基因治療組；D：六味地黃丸治療組； E：聯(lián)合治療組 第五十五頁，共七十四頁。病理檢查結(jié)果(光鏡觀察 ) 模型對照組 模型對照組：腫瘤組織內(nèi)可見

18、細胞密集，細胞內(nèi)可見黑色素 自殺基因治療組腫瘤組織內(nèi)可見細胞密集細胞內(nèi)可見黑色素 六味地黃治療組腫瘤組織內(nèi)可見密集的腫瘤細胞聯(lián)合治療組腫瘤組織內(nèi)可見細胞密度稍降低 各組細胞密度第五十六頁，共七十四頁。模型對照組腫瘤內(nèi)可見大片壞死組織 自殺基因治療腫瘤內(nèi)可見大片壞死組織六味地黃治療組腫瘤內(nèi)可見大片壞死組織 聯(lián)合治療組腫瘤內(nèi)可見壞死組織 各組腫瘤壞死情況第五十七頁，共七十四頁。模型對照組腫瘤周圍無明顯胞膜形成 自殺基因治療組腫瘤周圍見薄層假包膜 六味地黃丸治療組：腫瘤周圍見薄層假包膜 聯(lián)合治療組腫瘤周圍明顯的假包膜形成 各組腫瘤纖維結(jié)締組織增生情況第五十八頁，共七十四頁。模型對照組腫瘤周圍組織內(nèi)見

19、少量炎癥細胞浸潤 自殺基因治療組腫瘤周圍組織內(nèi)見少量炎癥細胞浸潤 六味地黃丸治療組腫瘤周圍組織內(nèi)有較多炎癥細胞浸潤 聯(lián)合治療組腫瘤間質(zhì)及周圍組織內(nèi)見多量淋巴細胞浸潤 各組腫瘤組織炎細胞浸潤情況第五十九頁，共七十四頁。惡性黑色素瘤治療實驗結(jié)論六味地黃丸對自殺基因治療小鼠移植性惡性黑色素瘤具有增效作用 第六十頁，共七十四頁。細胞水平實驗第六十一頁，共七十四頁。中藥成分聯(lián)合tk/GCV系統(tǒng)對肝癌細胞的殺傷作用中藥成分對肝癌細胞的作用(確定篩選藥物及聯(lián)合用藥劑量) Q值法分析聯(lián)合作用是否有協(xié)同性 有效中藥成分增效機制探討 有效中藥成分對細胞周期、細胞凋亡率的影響有效中藥成分對肝癌細胞GJIC的影響自身

20、旁殺傷效應(yīng)檢測大鼠肝癌細胞tk -、tk+細胞對GCV敏感性檢測決定采用的GCV濃度建立大鼠肝癌細胞 tk/GCV系統(tǒng)技術(shù)路線第六十二頁，共七十四頁。大鼠肝癌細胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+對GCV敏感性（MTT法，72h） 第六十三頁，共七十四頁。CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+不同混合比例對tk/GCV系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)的影響(MTT法） 組別tk+ 細胞比例（）存活率（%）GCV15.7M1098.25.52592.610.931071.09.0 a42057.35.2 b54048.87.0 b66031.03.5 b25.94.6 b7100aP

21、0.05, bP 0.01,與組1比較 第六十四頁，共七十四頁。(一)六味地黃丸藥物血清聯(lián)合不同比例tk/GCV系統(tǒng)對大鼠肝癌細胞的作用觀察第六十五頁，共七十四頁。血清（%） GCV GCV 5%tk/GCV(0M) (39.2M) (39.2M) 對照 對照 對照 含藥 含藥 含藥 Q值057.5100.0015.24 69.7015.12 63.601.71122.045.99 109.6711.85 94.786.86 128.7911.91 109.539.71 69.8728.12 a128.060.90 105.477.71 90.519.85 120.069.27 93.584.

22、96 56.8613.71 a1.191.12 (meanSD n=3)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 5%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h) 第六十六頁，共七十四頁。血清（%） GCV GCV 10%tk/GCV(0M) (39.2M) (39.2M) 對照 對照 對照 含藥 含藥 含藥 Q值057.5100.0015.63c 85.596.37ac 72.408.48b 89.0612.85c 73.46+12.55c 76.4016

23、.17b 91.069.69c 84.586.25c 55.9713.06abd 97.4512.60c 91.888.34cb 75.1611.99b 92.7711.11c 87.891.87db 57.798.45bd1.231.73 (meanSD n=6)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h) 第六十七頁，共七十四頁。10%tk/GCV，7.5%對照血清孵育12h10%tk/GCV，7.5%含藥

24、血清孵育12h第六十八頁，共七十四頁。血清（%） GCV GCV 10%tk/GCV(0M) (39.2M) (39.2M) 對照 對照 對照 含藥 含藥 含藥 Q值057.5100.006.28 83.509.35 69.578.78 77.133.17 72.937.94 71.983.11 a 113.664.19 84.159.57 74.8016.66 a 94.0710.08 68.848.88 66.3111.61 a 90.473.17 79.8810.09 66.5317.79 a1.041.26 (meanSD n=3)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)（Serum:24h） 第六十九頁，共七十四頁。血清（%） GCV GCV 20%tk/GCV(0M) (39.2M) (39.2M) 對照 對照 對照 含藥 含藥 含藥 Q值057.5100.001.30 73.107.93 60.9511.83 67.264.50 64.544.01 46.893.84 83.298.89 70.459.14 41.934.54 a81.736.96 76.566.36 58.155.87