T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子檢測

1、T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子檢測T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子檢測T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子檢測T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4檢測方法流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理：直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培養(yǎng)(協(xié)助性T細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子IFN-、IL-4的產(chǎn)生疏為Thl、Th2兩個亞群。淋巴細(xì)胞活化今后才分泌細(xì)胞因子，且快速分泌到細(xì)胞外。因此，利用刺激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細(xì)胞，爾后用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)控制劑Monensin阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)滯留到必然的量)，爾后進(jìn)行細(xì)胞膜表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色

2、，使用流式細(xì)胞儀對CD4+細(xì)胞內(nèi)的IFN-和IL-4進(jìn)行測定。標(biāo)本采集與辦理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于平時狀態(tài)，空腹采血。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求1樣本量最少1ml。樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)辦理，冷凍的標(biāo)本不能夠用。3樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在109/L之間。若10.0109/L，9樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.010/L，應(yīng)分別單個核細(xì)胞。溶血樣本不能夠用。試劑淋巴細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(自配)成分：刺激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。選白美國SIGMA企業(yè)。單克隆抗體CD4PC5、IL-4-PE、IFN-FITC選自美國BeckmanCoulter企業(yè)。質(zhì)控

3、品BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保留，可在有效期內(nèi)保持牢固，稀釋的試劑于2-8可牢固2周；每日校準(zhǔn)一次：遇特別情況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra操作：細(xì)胞培養(yǎng)與染色取200ul抗凝血加入lOulCD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMIl640沖洗一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)系統(tǒng)中，5C0237孵育18小時，取出后以PBS洗一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分紅兩管，其一為測定管加入抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型比較，室溫避光20分鐘，PBS沖洗一次，待測。流式細(xì)胞儀測定翻開流

4、式細(xì)胞儀及氬激光光源(488nm)預(yù)熱20min，同時儀器自動初始化；用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，爾后依次檢測標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測50000以上細(xì)胞，在前向散射光(FS)和測向散射光(SSC)散點圖中圈定淋巴細(xì)胞群，爾后分析CD4陽性細(xì)胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表達(dá)。淋巴細(xì)胞在FSSSC散點圖中地址，即A門內(nèi)細(xì)胞；A門內(nèi)CD4陽性細(xì)胞，即B門內(nèi)細(xì)胞；B門內(nèi)TH細(xì)胞亞群散布：區(qū)數(shù)值-Th1細(xì)胞(%)區(qū)數(shù)值-Th2細(xì)胞(%)2區(qū)數(shù)值-Th0細(xì)胞(%)報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精巧度批內(nèi)五次重復(fù)CV2矯捷度5001000個熒光素分子正常參照值Thl(IFN-)：17.395.52%Th2

5、(IL-4)：1.500.44%ThO：0.510.26%臨床意義淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子：Thl細(xì)胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-為Thl最特異分泌的細(xì)胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細(xì)胞因子，因此可依照分泌的細(xì)胞因子來劃分Thl與Th2。Thl為IFN-+，Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)(人的正常生理狀態(tài)、即未受到任何刺激下Th0分化為Thl和Th2的能力特別弱，在外周血中僅含有極少量的Thl和Th2細(xì)胞，這時我們所能檢測的胞內(nèi)的IFN-和IL-4也微乎其微。當(dāng)Th細(xì)胞碰到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中Th0即會向Thl或Th2大量分化，此時我們檢測到的IFN-和IL-4或很多。本實驗的檢測實際上是檢測Th細(xì)胞對刺激素刺激的反響能力。方案（Protocol）內(nèi)容總結(jié)（1）T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4檢測方法流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理：直接免疫熒光法（2）淋巴細(xì)胞活化今后才分泌細(xì)胞