流式細胞儀分析技術及應用醫(yī)學課件

1、 流式細胞儀 分析技術及應用 流式細胞儀 FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術。什么是流式細胞術(FCM)？ FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個特點: 單細胞的流動的 活細胞的 定量的 多參數(shù)的 高統(tǒng)計學精度的 分選細胞特點:第一節(jié) 流式細胞儀的分析及分選原理第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析第三節(jié) 流式細胞儀分析的技術要求第四節(jié) 流式細胞術在免疫學檢查中應用第一節(jié) 流式細胞儀的分析及分選原理 一 工作原理： FCM是一種在計算機技術支持下的高度自動化的細胞顯微熒光脈沖分光光度儀。第一節(jié) 流式細胞儀的分析及分選原理 一

2、 工作原理：第一節(jié) 流式細胞儀的分析及分選原理 1、液流系統(tǒng) 樣品流和鞘流 2、光學系統(tǒng) 激光、透鏡組、 光電倍增管等。 3、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(一） 基本組成構 1、液流系統(tǒng) 樣品流和鞘流(一） 基本組成構Injector Tip熒光信號激光束Sheath fluid樣品流和鞘流1、液流系統(tǒng)Injector 熒光信號激光束Sheath樣品流和鞘流1、PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell 激光、透鏡組、光電倍增等。2、光學系統(tǒng) PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBan（二） 基本工作原理（二）

3、基本工作原理單細胞流：流動室單細胞流：流動室單細胞照明：激光488 nm laser單細胞照明：激光488 nm laser488 nm laser單細胞檢測：信號處理488 nm laser單細胞檢測：信號處理（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信號的強弱與細胞的大小相關（二）側(cè)向散射光（side scatter)：SSC 信號的強弱與細胞內(nèi)的顆粒多少相關二 散射光的測定（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC二FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter細胞對光的散色現(xiàn)象與細胞樣品制備無關.FALS Sen

4、sorLaserForward Angle 90 Degree Light ScatterFALS Sensor90LS SensorLaser細胞對光的散色現(xiàn)象與細胞樣品制備無關.90 Degree Light ScatterFALS Se前向散色光FSC前向散色光FSC側(cè)向散色光SSC側(cè)向散色光SSC 利用前向角和測向角散射光可以把外周血白細胞分成三群，淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。散射光的測定 利用前向角和散射光的測定 熒光檢測器檢測特定熒光的特定發(fā)射波長（一）光信號測量 線性放大器 對數(shù)放大器三 熒光測量 熒光檢測器檢測特定熒光的特定發(fā)射波長三 熒光測量EthidiumPEcis-Par

5、inaric acidTexas RedPE-TR Conj.PIFITC600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610632488Common Laser LinesEthidiumPEcis-Parinaric acidTeDNAExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmDNAExcitationEmisson300 nm （二）熒光補償 利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的技術稱“熒光補償”（二）熒光補償 利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰流式細胞儀分析技術

6、及應用醫(yī)學課件（一）分選的基本原理488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector四 細胞分選原理（一）分選的基本原理488 nm laser+-Charge陽性選擇MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分離陰性選擇陽性選擇MACS-Magnetic Cell Sorting1 、分選速度：幾千個細胞/秒2 、分選純度:99.5%左右3 、分選收獲率:90-95%4 、分選得率（二）分選的技術要求1 、分選速度：幾千個細胞/秒（二）分選

7、的技術要求 分選純度 是指分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比。 分選收獲率 是指分離后所得的細胞亞群數(shù)占原細胞樣品中該亞群細胞數(shù)的百分比。 分選純度第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示和分析 一、參數(shù)前向散射光FS: 反映顆粒的大小側(cè)向散射光SS: 細胞內(nèi)部結(jié)構復雜程度熒光FL: 細胞被染上熒光部分數(shù)量的多少第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示和分析 一、參數(shù)二、數(shù)據(jù)的顯示方式（一） 單參數(shù)直方圖（二） 雙參數(shù)顯示（三） 三參數(shù)顯示二、數(shù)據(jù)的顯示方式（一） 單參數(shù)直方圖（二） 雙參數(shù)顯示（三 以分布直方圖( distribution histogram )來顯示，橫軸為該參數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以是線性的，也

8、可以是對數(shù)的?？v軸一般是細胞數(shù)或細胞出現(xiàn)的頻數(shù)。(一) 單參數(shù)直方圖的顯示Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方圖( distribution histX軸表示綠熒光信號(CD3)強弱,Y軸則反應細胞的數(shù)量.X軸表示綠熒光信號(CD3)強弱,Y軸則反應細胞的數(shù)量.流式細胞儀分析技術及應用醫(yī)學課件流式細胞儀分析技術及應用醫(yī)學課件(二)雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示Two-Parameter Data Displays 細胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個參數(shù)各自與細胞數(shù)量的關系，更重要的是獲得了這二個參數(shù)之間的相關關系，其中包含了更多的生物學信息。雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用的是二

9、維的散點圖( Dot Plot )。在二維圖上，橫軸代表第一個測量參數(shù)，縱軸代表第二個測量參數(shù)。(二)雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示 細胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個參數(shù)各 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù),在圖中每一個點代表一個細胞1 、點圖 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量1 、點圖 用等高線來表示細胞數(shù)，在一條等高線上細胞數(shù)相同，不同的等高線上細胞數(shù)不同。2 、二維等高圖 用等高線來表示細胞數(shù)，在一條等高線上細胞數(shù)相2 、二維 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù),Z軸為細胞數(shù)。3 、假三維等高圖 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù),Z軸為細胞數(shù) 三維坐標勻為參數(shù)（散射光或熒光）而非

10、細胞數(shù)。(三) 三參數(shù)直方圖 三維坐標勻為參數(shù)（散射光或熒光）而非細胞數(shù)。(三) 三參 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設門（Gate)技術，來分析參數(shù)之間的相互關系。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設門（Gate)（四）流1 、Region設置1 、Region設置2 、 設置Gate2 、 設置Gate 樣品制備：單細胞懸液 特定熒光染料的選擇：光譜重疊 陰性對照的設置:檢測標本的重復性 質(zhì)量控制第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求 樣品制備：單細胞懸液第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求 細胞碎片 細胞團塊 離心漂洗 固定劑一、免疫檢測樣品制備 細胞碎片一、

11、免疫檢測樣品制備流式細胞儀分析技術及應用醫(yī)學課件 淋巴細胞分離液分離外周血中單個核細胞。Ficoll,40kd，高密度，低滲透壓，無毒性。（比重為1.01770.001的分層液).（一）外周血淋巴細胞樣品的制備 淋巴細胞分離液分離外周血中單個核細胞。（一）外周血淋 利用紅細胞裂解液去除紅細胞后，得到外周血中所有白細胞的流式細胞分析的二維散色光點圖 利用紅細胞裂解液去除紅細胞后，得到外周血 單層培養(yǎng)細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮培養(yǎng)細胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細胞懸液。（二) 培養(yǎng)細胞的樣品制備 單層培養(yǎng)細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法（二

12、) 培養(yǎng)細 機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。 酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學試劑處理法：EDTA、EGTA等。 表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。(三)新鮮實體組織單細胞懸液的制備 機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。(三)新鮮實體組織單細胞 機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團塊等，也可利用電子學技術處理的方法排除團塊和碎片的干擾。 酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學成份的不良影響。FCM所測細胞是單個分散狀態(tài)；對細胞團塊，細胞碎片盡可能少；細胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處

13、理不受影響。 機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細胞產(chǎn)量。防止細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細胞不具有生物活性，但 細胞表面熒光染色分析不受影響。(四）單細胞懸液的保存防止細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法：(四）單細胞懸 染料的選擇和標記染色保證了熒光信號的產(chǎn)生（一）免疫熒光標記最常用的熒光染料熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色FITC 488 525 深藍色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙紅色PeCy

14、-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633 670 紅色FITC 488 525 深藍色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633 670 紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色 染料的選擇和標記染色保證了熒光信號的產(chǎn)生熒光染料 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號。LaserCY5PECY5CY5488nm能量傳遞

15、染料： 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在Lase熒光染料與細胞成分的結(jié)合方式： 結(jié)構親和方式 嵌入結(jié)合方式 共價結(jié)合方式 熒光抗體特異性結(jié)合方式1、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色（二）免疫熒光標記熒光染料與細胞成分的結(jié)合方式：（二）免疫熒光標記3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色FITC+T red 488 525 綠色 568 615 紅色FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色F+

16、 ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、 橙紅色、紅色F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記FITC+PE FITC的激發(fā)波長處于自發(fā)熒光的光譜區(qū)內(nèi)，因此FITC熒光易受自發(fā)熒光的干擾。(三) 細胞的自發(fā)熒光 FITC的激發(fā)(三) 細胞的自發(fā)熒光（一）單細胞懸液制備的質(zhì)量控制（二）細胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制 1、溫度對熒光染色的影響 2、pH對熒光發(fā)射強度的影響 3、熒光染料濃度的控制 4、固定劑對熒光染色的影響（三）儀器操作技術的質(zhì)量控制三、流式細胞

17、免疫學技術的質(zhì)量控制（一）單細胞懸液制備的質(zhì)量控制三、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控 1、同型對照：選用相同源性的未標記單抗作為同型對照（陰性對照） 2、全程質(zhì)控：在流式檢測中，樣品標記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機檢測的過程都會直接影響檢測結(jié)果。采用標準質(zhì)控樣品來進行全程質(zhì)控，使得同類實驗室建立質(zhì)控比對，數(shù)據(jù)可以互用。（四）免疫檢測的質(zhì)量控制 1、同型對照：選用相同源性的未標記單抗作為（四）免疫檢測一、淋巴細胞及其亞群的分析 淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)中的一群重要細胞群，是參與免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行細胞免疫功能的免疫活性細胞，T細胞、B細胞和NK細胞，各自發(fā)揮不同的作用。第四節(jié) 流式細胞在免疫學檢查中的應

18、用一、淋巴細胞及其亞群的分析第四節(jié) 流式細胞在免疫學檢查中的應三色標記 淋巴細胞T、B、 NK三色標記 淋巴細胞T、NK1、Th 細胞：CD3+ CD4 + CD8-T細胞，能輔助B細胞分化成熟生成抗體產(chǎn)生細胞（槳細胞），參與促進細胞介導的免疫應答。（一）淋巴細胞及其亞群分析1、Th 細胞：（一）淋巴細胞及其亞群分析2、Tc細胞： CD3+ CD4 - CD8 +T細胞，能特異性直接殺傷靶細胞，所有表達MHC I類分子的靶細胞?？鼓[瘤免疫，抗病毒感染，移植排斥反應和自身免疫疾病中均起了重要作用。2、Tc細胞： CD3+ B細胞約為5%-10%，標志為BCR，膜表面免疫球蛋白（Smlg）。表達C

19、D19、 CD20、CD21、CD22分子。B細胞也是免疫系統(tǒng)重要的免疫細胞，主要功能是介導體液免疫?？乖f呈細胞，能攝取、加工和遞呈抗，同時還能分泌細胞因子調(diào)節(jié)免疫應答。(二）B淋巴細胞及其亞群 B細胞約為5%-10%，標志(二）B淋巴細胞及其亞群 自然殺傷細胞（Natural killer cell,NK 細胞）為一組大顆粒的淋巴細胞，5%-10% 左右，標志CD16、CD56、CD2、CD11a/CD18。用三色熒光標記將CD3-CD16+CD56+淋巴細胞定為NK細胞。主要功能是參與細胞免疫，在腫瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用。（三）NK細胞分析 自然殺傷細胞（Natural killer cell, （一）細胞介導細胞毒性試驗（二）細胞內(nèi)細胞因子測定 小分子可溶性蛋白質(zhì) T細胞和巨噬細胞 參與細胞免疫、體液免疫、炎癥反應、造血調(diào)控、細胞增殖和分化、損傷修復重要生理和病理過程。二、淋巴細胞功能分析 （一）細胞介導細胞毒性試驗二、淋巴細胞功能分析流式細胞細胞因子分析圖流式細胞細胞因子分析圖流式細胞細胞因子分析圖流式細胞細胞因子分析圖三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原 及白血病免疫分型 用多參數(shù) FCM測定白血病免疫表