槲皮素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

1、PAGE 10 -槲皮素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用林雪梅王小林唐春紅摘要目的探討棚皮素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+棚皮素組。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷局灶性腦缺血模型，缺血2h，再灌注24h;假手術(shù)組僅暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合。缺血再灌注+棚皮素組大鼠在缺血30min后腹腔注射棚皮素50mg/kg，假手術(shù)組及缺血再灌注組大鼠按相同方式給予等體積溶劑。再灌注24h后評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能狀態(tài)、腦組織含水量，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，制備腦組織勻漿并測(cè)定腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MD

2、A）含量。結(jié)果腹腔注射棚皮素后，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低、腦組織含水量下降、腦組織內(nèi)SOD活性增加、MDA含量降低、腦組織損害減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論棚皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化途徑保護(hù)腦缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷。關(guān)鍵詞缺血再灌注;抗氧化;槲皮素;神經(jīng)保護(hù)中圖分類(lèi)號(hào)R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)2095-0616（2022）01-0024-04ProtectiveeffectofquercetinonfocalcerebralischemiareperfusioninjuryinratsLINXuemei1，2WANGXiaolin1，2TANGChunhong21.Sectiono

3、fPathologyTeachingandResearch，NorthSichuanMedicalCollege，Sichuan，Nanchong637000，China;2.DepartmentofPathology，AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Sichuan，Nanchong637000，ChinaAbstractObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectandmechanismofquercetinonfocalcerebralischemia-reperfusioninjuryin

4、rats.MethodsAtotalof54maleSDratswererandomlydividedinto3groups，whichweretheshamoperationgroup，theischemia-reperfusiongroup，andtheischemia-reperfusionplusquercetingroup.Themodeloffocalcerebralischemiainratswithmiddlecerebralarteryocclusionwasmadebysuturemethod，andthemodelwasischemiafor2handreperfusio

5、nfor24h.Intheshamoperationgroup，onlycommoncarotidarterywasexposedandsutured.Ratsintheischemia-reperfusionplusquercetingroupwereinjectedwithquercetin50mg/kgintraperitoneallyafterischemiafor30min，whileratsintheshamoperationgroupandtheischemia-reperfusiongroupweretreatedwiththesamevolumeofsolventinthes

6、ameway.24hafterreperfusion，theneurologicalfunctionandwatercontentofbraintissuewereevaluated，themorphologicalchangesofbraintissuewereobserved，thehomogenateofbraintissuewasprepared，andtheactivityofsuperoxidedismutase（SOD）andthecontentsofmalondialdehyde（MDA）inbraintissueweredetected.ResultsAfterintrape

7、ritonealinjectionofquercetin，theneurologicalfunctionscoreofratsdecreased，thewatercontentofbraintissuedescended，theactivityofSODinbraintissueincreased，thecontentofMDAdecreasedandthedamageofbraintissuealleviated，withstatisticallysignificantdifferences（P0.05）.ConclusionQuercetincanprotectneurologicalin

8、jurycausedbycerebralischemia-reperfusionbyregulatingantioxidantpathway.KeywordsIschemia-reperfusion;Antioxidant;Quercetin;Neuroprotection缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是指器官血流減少或中斷，隨后血流再灌注及細(xì)胞復(fù)氧，從而引起組織細(xì)胞損傷1-2，這一損傷過(guò)程涉及氧自由基的生成3、鈣離子內(nèi)流4、補(bǔ)體激活5、toll樣受體激活和炎癥反應(yīng)6-9等多種復(fù)雜機(jī)制。槲皮素作為一種強(qiáng)自由基清除劑10，不斷地被用于全身各器官缺血再灌注損傷模

9、型保護(hù)性研究，包括心、肝、腎、睪丸、骨骼肌等11。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過(guò)多種途徑發(fā)揮腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用，包括激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosissignal-regulatingkinase1，ASK1）/c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡12、減少白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥遞質(zhì)抑制炎癥反應(yīng)13、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase，MMP-9）維持血腦屏障完整性14及以提高腦組織內(nèi)硫氧還蛋白含量發(fā)揮抗氧化應(yīng)激15等。雖然槲皮素已經(jīng)被運(yùn)用于腦缺血再灌注損傷的

10、保護(hù)作用及機(jī)制研究，但相關(guān)治療臨床前研究指南指出，在腦缺血性損傷的藥物研究中應(yīng)選擇多重指標(biāo)16。故本研究采用局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察槲皮素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑雄性SD大鼠由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，重量為250300g。槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich，純度98%。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司。1.2藥物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+槲皮素

11、組，每組各18只。將槲皮素溶解于二甲基亞砜，配制藥物濃度50mg/ml備用。按50mg/kg劑量在缺血30min后經(jīng)腹腔注射給予缺血再灌注+槲皮素組大鼠藥物，假手術(shù)組和缺血再灌注組則按相同方式給予等體積溶劑。1.3動(dòng)物模型的制備用線栓法制備動(dòng)物模型。用石蠟包裹、頭端呈梭形的0.24mm魚(yú)線做線栓。術(shù)前禁食12h，自由飲水，腹腔注射0.35%水合氯醛麻醉（0.1ml/kg）大鼠，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈壁剪一破口，線栓經(jīng)破口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，過(guò)頸動(dòng)脈分叉處繼續(xù)進(jìn)線約2cm時(shí)稍感阻力，提示線栓已經(jīng)到達(dá)左側(cè)大腦中動(dòng)脈并阻斷大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流，造成大鼠左側(cè)腦組織缺血性損傷。隨即將線栓固定在頸總動(dòng)脈

12、，縫合傷口。栓塞缺血2h后退出線栓再灌注24h。假手術(shù)組大鼠僅暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合。1.4神經(jīng)功能評(píng)分再灌注24h后，根據(jù)Zea-longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)15觀察大鼠行為學(xué)變化并評(píng)分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀為0分;不能伸展右側(cè)前爪為1分;行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分;行走時(shí)向右側(cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分。13分為有效模型。1.5腦組織含水量測(cè)定每組6只，大鼠腦缺血再灌注24h后，斷頭取腦，去除腦表面的硬脊膜、小腦及腦干部分，立即用微量精密天平稱(chēng)取大腦組織重量，然后放入烘箱，80烘72h至恒重，稱(chēng)取干重。腦含水量=（腦濕重-腦干重）/腦濕重100%。1.6大鼠腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察每組6只，大鼠腦缺血再

13、灌注24h后，斷頭取腦，10%福爾馬林溶液固定24h，取材、固定、脫水、包埋、3m切片后行蘇木素-尹紅染色。1.7腦組織內(nèi)SOD活性及MDA含量測(cè)定每組6只，大鼠腦缺血再灌注24h后，斷頭取腦，剪取少量顏色晦暗、腫脹區(qū)域（即梗死區(qū)）腦組織稱(chēng)重，然后置于勻漿器中進(jìn)行手工勻漿，制備10%腦組織勻漿，2000r/min離心15min，取其上清液，參照南京建成生物技術(shù)有限公司試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)腦組織勻漿中SOD活性及MDA含量。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理2結(jié)果2.1槲皮素對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量的影響與缺血再灌注組比較，腹腔注射50mg/kg槲皮素能顯著降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

14、義（P0.05）。見(jiàn)表1。2.2槲皮素對(duì)各組大鼠腦組織SOD活性及MDA含量的影響與缺血再灌注組比較，腹腔注射50mg/kg槲皮素能顯著提高腦組織內(nèi)SOD活性及降低MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。見(jiàn)表1。2.3槲皮素對(duì)各組大鼠腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)改變的影響假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞排列整齊、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、組織間質(zhì)均勻紅染無(wú)異常。缺血再灌注組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂、可見(jiàn)核固縮及細(xì)胞水腫、組織間質(zhì)內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松淡染、并見(jiàn)小空泡。與缺血再灌注組比較，腹腔注射50mg/kg槲皮素后，大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、密度增加，發(fā)生核固縮和水腫的細(xì)胞數(shù)量均減少，組織間質(zhì)水腫程度減輕。見(jiàn)圖1。3討論槲皮素

15、是一種天然黃酮類(lèi)化合物，廣泛存在于各種蔬菜水果中，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗感染、抗腫瘤、擴(kuò)張血管、治療代謝性和心血管疾病等多種藥用價(jià)值17。研究表明其對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但根據(jù)相關(guān)治療臨床前研究指南，在腦缺血性損傷的藥物研究中除了選擇多重指標(biāo)外，其評(píng)價(jià)應(yīng)包括組織和行為學(xué)結(jié)果16。發(fā)生腦缺血再灌注時(shí)，血管通透性增強(qiáng)，血管源性腦水腫形成;隨著細(xì)胞復(fù)氧，線粒體功能受損，活性氧生成增加，從而誘導(dǎo)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、凋亡甚至梗死18，故而動(dòng)物可出現(xiàn)一系列異常的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。因此，本研究量化統(tǒng)計(jì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、評(píng)價(jià)腦組織含水量、觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，可以反映大鼠腦缺血再灌

16、注的損傷程度。與缺血再灌注組比較，腹腔注射槲皮素后，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量均明顯下降。提示槲皮素能改善腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)功能損害及腦水腫。此外，發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，腦組織損傷體現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少、核固縮、細(xì)胞水腫，腦組織間質(zhì)內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松淡染及小空泡形成。而腹腔注射槲皮素后，腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、密度增加、核固縮和水腫細(xì)胞數(shù)量均減少，腦組織間質(zhì)水腫程度減輕，這些形態(tài)學(xué)改變與大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量改變趨勢(shì)是一致的，提示槲皮素可減輕腦缺血再灌注損傷引起的損傷。腦缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，其中內(nèi)源性抗氧化因子減少、氧自由基增加以及隨后的氧化應(yīng)激被認(rèn)為在缺血再灌注中起著關(guān)鍵作用

17、。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，包括MDA、酮基、羥基等。因此，MDA含量高低可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度。而SOD可通過(guò)歧化反應(yīng)清除體內(nèi)生成的氧自由基、阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷19，其活性高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。與缺血再灌注組比較，本研究結(jié)果提示，槲皮素能顯著提高SOD活性、降低MDA含量，提示槲皮素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制可能與其抗氧化特性有關(guān)。綜上所述，槲皮素可改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后引起的神經(jīng)功能損害，減輕腦水腫及腦組織損害程度，提高內(nèi)源性抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。參考文獻(xiàn)1Wa

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