紫杉烷及鉑類聯(lián)合對宮頸癌Caski細(xì)胞的體外抑制作用

1、南華大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。 盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得南華大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。 本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名：年月日南華大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人同意南華大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即： 學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文， 允許學(xué)位論文被查閱和借閱； 學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容， 可以編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索， 可以采用復(fù)

2、印、縮印或其它手段保留學(xué)位論文； 學(xué)?？筛鶕?jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文。對于涉密的學(xué)位論文，解密后適用該授權(quán)。作者簽名導(dǎo)師簽名：年月日年月日2目錄中文摘要1英文摘要21前言42實驗設(shè)計73材料與方法84實驗結(jié)果165討論216結(jié)論24參考文獻25附錄29研究綜述30成果目錄39致謝401紫杉烷與鉑類聯(lián)合對宮頸癌Caski 細(xì)胞體外抑制作用碩士研究生：李星宇指導(dǎo)老師：陳忠東教授中文摘要目的為提出一種宮頸癌臨床化療用藥的最佳方案，探討了順鉑（DDP）、卡鉑CBP）、奈達(dá)鉑（ NDP）、紫杉醇（ TXL ）和多西紫杉醇（ DXL ）5 種臨床常用化療藥物單獨和聯(lián)合使用對宮頸癌 Caski

3、細(xì)胞的抑制作用， 以及聯(lián)合用藥時對caspase-3蛋白表達(dá)的影響。方法以宮頸癌 Caski 細(xì)胞為研究對象，將順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇和多西紫杉醇 5種化療藥物分別單獨作用于宮頸癌Caski 細(xì)胞 48 小時，采用 MTT 比色法比較 5種藥物的敏感程度。 再對比紫杉烷與鉑類聯(lián)合作用， 將 5 種單藥設(shè)置成六種不同用藥組合，每種組合分為同時加藥并作用48 小時和兩種藥物間隔 24小時先后加藥兩類方式，用藥濃度取各自的IC50 值，計算各組藥物的抑制率，并用 Western blotting 法檢測聯(lián)合用藥各組的caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果上述 5 種藥物的體外藥敏試驗結(jié)果表明：敏感性由

4、高到低的順序為順鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、卡鉑和多西紫杉醇，且各種藥物呈劑量依賴性。在IC50 濃度下，聯(lián)合用藥組MTT 比色法發(fā)現(xiàn)：不同用藥組合之間的抑制率各不相同，紫杉烷類與鉑類之間存在交互作用 （P0.05）,其合并效應(yīng)呈現(xiàn)出不同程度的相加（ Q值 0.85）。其中，卡鉑與紫杉醇、順鉑與紫杉醇、奈達(dá)鉑與紫杉醇三種聯(lián)合用藥方案對宮頸癌 Caski 細(xì)胞的增殖抑制率相對較強。 Western blotting 結(jié)果顯示卡鉑與紫杉醇、順鉑與紫杉醇、奈達(dá)鉑與紫杉醇三種聯(lián)合用藥組的 caspase-3表達(dá)比其他三組增加，與 MTT 比色法結(jié)果一致。結(jié)論 (1)5 種藥物均不同程度的誘導(dǎo)宮頸癌 Caski

5、 細(xì)胞凋亡，敏感性順序為順鉑奈達(dá)鉑紫杉醇卡鉑多西紫杉醇，且各藥物呈劑量依賴性； (2)紫杉烷類與鉑類聯(lián)合用藥后的效應(yīng)可產(chǎn)生不同程度的疊加效應(yīng)， 其中卡鉑與紫杉醇、 順鉑與紫杉醇、奈達(dá)鉑與紫杉醇三種聯(lián)合用藥方案對 Caski 細(xì)胞的抑制率相對較高，且給藥順序?qū)?Caski 細(xì)胞的抑制率無明顯影響； (3)卡鉑與紫杉醇、順鉑與紫杉醇、奈達(dá)鉑與紫杉醇中的 caspase-3蛋白表達(dá)較多西紫杉醇聯(lián)合三種鉑類組增強。關(guān)鍵詞： 宮頸癌；聯(lián)合化療；細(xì)胞凋亡； caspase-3。1A Taxane and Platinum on cervical cancer Caski cells invitro inh

6、ibitory effectAbstractPostgraduate: Xing-Yu LiDirected by: Professor Zhong-Dong Chen( Medcine of Gynaecology and Obstetrics )Objective: To put forward a kind of best scheme for cervical cancer chemotherapy drugs for clinical application, five kinds of commonly used clinical chemotherapy drugs, inclu

7、ding Cisplatin (DDP), Carboplatin (CBP), Nedaplatin (NDP), Paclitaxel (TXL) and Docetaxel (DXL), considering their alone action and their pair-drugs coaction modes, the inhibition effect on cervical cancer Caski cells will be explored, and also the effect of combination scheme on the Caspase-3 prote

8、in expression will be discussed.Method: The fresh in vitro culture cervical cancer Caski cells are taken as theresearch object, which are divided into several trial groups, five kinds of chemotherapeutic drugs, including Cisplatin, Carboplatin, Paclitaxel, Docetaxel and Nedaplatin, are taken to effe

9、ct on cervical cancer Caski cells for 48 hours respectively, and then the comparison action sensitivity of the cancer cell to each drug is obtained by MTT colorimetric method. What smore, the combined effects of Taxane and Platinum drugs are considered, in this case, the trial dosing drugs combinati

10、on are set into six kinds of drugs-pairs, and each drugs-pair combination are assigned into three groups with different dosing schemes, which are dosing at one time for 48 hours and sequence dosing with interval of 24 hours, in which the concentration of each drug is taken as the IC50 values respect

11、ively. Then, the growth inhibition rate of cells in each drug-pair combination would be obtained and caspase-3 protein expression could be detected by Western blotting method.Results s found erthatof thedrugsordinhibition: From the results given above, itsensitivity, from high to low, are Cisplatin,

12、 Nedaplatin, Paclitaxel, Carboplatin,and2Docetaxel, and they are dose dependent to all kinds of drugs. The results of these experiments under dosing of IC50 concentration show that, within each drug-pair combination, the three groups with different dosing schemes lead to the same inhibition rate, an

13、d the difference has no statistically significant (P 0.05), it is to say that the different dosing sequenceshas little effect on inhibition rate. Then, in each drug-pair combination take the dosing at one time for instance, the results of inhibition rate are compared among the six kinds of drug-pair

14、s combination, between which has significant difference (P 0.05). Among them, the Carboplatin and Paclitaxel, Cisplatin and Paclitaxel, Nedaplatin and Paclitaxel, three combination of drugs on cervical cancer Caski cell proliferation inhibition rate is relatively strong.Western blotting indicated th

15、at Carboplatin and Paclitaxel, Cisplatin and Paclitaxel, Nedaplatin and Paclitaxel combination of three caspase-3expression more than the other three groups, consistent with the results determined by MTT colorimetry.Conclusion:All the five kinds of drugs could induce cervical cancer Caski cells apop

16、tosis in some degree, and the order of drugs inhibition sensitivity, from high to low, are Cisplatin, Docetaxel, Cisplatin, Paclitaxel and Carboplatin, and each drug is dosing dependent.The pair-drug combination of Taxane and Platinum synergistic shows synergistic effect, while the dosing sequence h

17、as little effect on inhibition rate.The pair-drugs of Carboplatin and Paclitaxel, Cisplatin and Paclitaxel, Nedaplatin and Paclitaxel make the expression level of caspase-protein3 be much higher.Keywords: cervical cancer; combined chemotherapy; apoptosis; caspase-3.31前言宮頸癌是一種最為常見的婦科腫瘤之一，為全世界范圍內(nèi)女性第二常

18、見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著全球女性的生命健康，并成為因惡性腫瘤導(dǎo)致婦女死亡的第二常見原因 1,2 。對我國近 50年宮頸癌特點進行回顧性分析 3 ：（ 1）發(fā)病年齡年輕化；（ 2）早期發(fā)現(xiàn)率上升，鱗癌較腺癌等其它類型比率增高；（ 3）分化程度低，非鱗癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率在年輕的宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)率較高。以往宮頸癌的治療方式主要是手術(shù)和放療， 即早期以手術(shù)治療為主， 中晚期大多采用放化療。 盡管手術(shù)技巧和放療技術(shù)得到了不斷的改進， 但根據(jù)近 30年來臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，各期宮頸癌的 5年生存率卻未見明顯提高 4,5 。近年來，隨著一些新型化療藥物的研制成功、 化療方案的完善以及給藥途徑的不斷更新， 化療已由晚

19、期姑息治療的手段進入有效的綜合治療行列 6 。學(xué)者建議在手術(shù)或放療前應(yīng)用新輔助化療方法 （ Neoadjuvant Chemotherapy，NACT ），目的是縮小宮頸癌瘤灶、提高手術(shù)切除率， 其次清除體內(nèi)可能存在的微轉(zhuǎn)移灶， 降低腫瘤活性， 減少手術(shù)中醫(yī)源性播散的可能 7 。一項隨機試驗比較了新輔助化療和手術(shù)與單純行手術(shù)治療兩種手段對患者生存情況的影響，結(jié)果表明接受新輔助化療的婦女總生存期(OS)和無進展生存期 (PFS)均有所提高 8 。一個隨機對照試驗表明 9 ，紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、順鉑與順鉑、 異環(huán)磷酰胺作為術(shù)前新輔助化療方案， 術(shù)后病理反應(yīng)率3個藥物聯(lián)合組顯著高于 2個藥物組 (4

20、8% vs 23%)，但是總生存期沒有差別。雖然國內(nèi)外對于 NACT 的藥物組合有眾多嘗試，但是最優(yōu) NACT 方案仍有待進一步確定。如何篩選出高效、 低毒的化療藥物或者化療藥物組合， 成為眾多醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的熱點。2012 年美國 NCCN（National Comp Rehensive Cancer Network）指南中推薦的化療藥物，可供選擇的一線單藥有順鉑（首選）、卡鉑、紫杉醇。二線治療藥物有多西紫杉醇、 貝伐單抗、吉西他濱、 5-氟尿嘧啶、異環(huán)磷酰胺、 伊立替康等，推薦的聯(lián)合用藥包括卡鉑和紫杉醇、順鉑 +紫杉醇、順鉑 +托泊替康、順鉑 +吉西他濱（ 2B 級證據(jù)） 10。目前以鉑類

21、為主的化療方案，仍然是宮頸癌化療的首選11,12 。鉑類（ Platinum）主要通過影響 DNA 合成來發(fā)揮藥理作用，是一種細(xì)胞周期4非特異性藥物。順鉑（ Cisplatin，DDP）于 1978年首先在美國批準(zhǔn)于臨床應(yīng)用，為第一代鉑類抗腫瘤藥物， 具有廣譜的抗腫瘤作用， 迄今為止被公認(rèn)為最有效的化療藥物之一，并被推薦用于復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的一線單藥化療 13 。另外還有較多關(guān)于中藥類藥物與順鉑共同作用的報道， 如?；撬?、茶多酚等與順鉑合用，其對宮頸癌細(xì)胞的體外抑制作用均強于單一順鉑用藥 14,15 。由于 DDP 的不良反應(yīng)限制了其在臨床上的應(yīng)用，之后醫(yī)學(xué)界又推出了鉑類的一些衍生品，

22、包括卡鉑和奈達(dá)鉑。卡鉑（ Carboplatin， CBP）第一個被臨床接受的第二代鉑類抗腫瘤藥，其作用機制與順鉑相同。 常見不良反應(yīng)有骨髓抑制、 胃腸道毒性及腎毒性等。被廣泛應(yīng)用于 NACT 、同步放化療中。奈達(dá)鉑 (Nedaplatin，NDP)，屬于順鉑的衍生物，于 1995年在日本上市，其抗癌作用機制與順鉑相同 16。有報道稱 NDP 具有 DDP 相似的治療效果，且其腎毒性和胃腸道不良反應(yīng)明顯低于DDP17，使其得到了廣泛臨床應(yīng)用。紫杉烷包括了紫杉醇和多西紫杉醇，屬于細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥。紫杉醇(Palitaxel，PTX)最初是從紫杉 (紅豆杉 )樹皮中分離提取的具有高效抗腫瘤活

23、性的天然產(chǎn)物，其抗癌機制主要是通過結(jié)合到微管蛋白上，促進微管蛋白的聚合,并阻滯其解聚成亞單位，從而凍結(jié)有絲分裂的紡錘體，使細(xì)胞停滯于G2/M 期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 18。一些學(xué)者通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可通過作用于Bcl-2 、 bax、Fas/Fasl、P53等凋亡相關(guān)基因促進細(xì)胞凋亡 19-21 。多西紫杉醇（ Docetaxel）即多西他賽，是從歐洲紫杉的針葉中提取，經(jīng)半合成而獲得，作用于 M 期，抑制細(xì)胞有絲分裂。有報道稱，多西紫杉醇具有抑制血管形成以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，相對于紫杉醇而言， 與微管蛋白的親和力更強， 作用于細(xì)胞內(nèi)的時間更長， 理論上對腫瘤細(xì)胞的破壞力更強 22 。一項期臨

24、床試驗顯示，應(yīng)用多西紫杉醇化療的難治性宮頸鱗癌患者，中位生存期為 7個月，最常報道的不良反應(yīng)表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞減少、感染、胃腸道不適等方面 23。由于化療藥物的選擇通常是根據(jù)臨床用藥經(jīng)驗和藥物適合大多數(shù)患者的特性來進行判斷的， 因此，由于這一缺乏患者針對性的傳統(tǒng)用藥方法，不可避免地導(dǎo)致相當(dāng)比例的患者出現(xiàn)過給藥錯誤的現(xiàn)象，據(jù)估計這一比例甚至高達(dá) 40%24 。以經(jīng)驗用藥為主的化療方案具有諸多局限性， 個體化治療越來越受到臨床醫(yī)生的重視。由于不同個體的腫瘤對化療藥物的敏感性存在著顯著差異， 單憑醫(yī)生的臨5床經(jīng)驗難以準(zhǔn)確把握。 目前臨床上常用經(jīng)典藥物來進行經(jīng)驗性化療， 其治療效果卻不甚理想。 因此，如

25、果能對每個腫瘤患者進行化療藥物的敏感性試驗， 篩選出敏感的藥物， 同時根據(jù)敏感藥物的作用譜的不同， 將化療藥物聯(lián)合作用， 就有可能提高化療療效，減少不良反應(yīng)，并防止耐藥性問題的產(chǎn)生。本文以宮頸癌 Caski細(xì)胞為研究對象，用 MTT 比色法比較臨床常用化療藥物順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、多西紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞的藥物敏感性，再根據(jù)聯(lián)合化療原則， 將紫杉烷與鉑類聯(lián)合作用。 根據(jù)給藥順序不同， 比較它們對細(xì)胞的增殖抑制作用強弱。 利用 Western blotting法檢測聯(lián)合用藥后 Caski細(xì)胞 caspase-3 蛋白的表達(dá)， 最終優(yōu)選出最佳化療組合， 為指導(dǎo)臨床用藥提供一定依據(jù)， 為進一步提

26、高宮頸癌化療療效的治療策略提供方法。6實驗設(shè)計2.1順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、多西紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞抑制作用的用藥方案體外培養(yǎng) Caski Cell1000、 100、 10 、 1、 0.1 、 0.01、空白（ ug/ml ）濃度的順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、多西紫杉醇MTT 法測細(xì)胞抑制率計算各自 IC50 活性圖 1單獨用藥方案2.2聯(lián)合用藥及單藥抑制作用的用藥方案聯(lián)合用藥各藥濃度均取各自IC50順鉑 +紫杉醇順鉑 + 多西紫杉醇IC50 順鉑IC50 卡鉑IC50 紫杉醇卡鉑 +紫杉醇卡鉑 + 多西紫杉醇IC50奈達(dá)鉑IC50多西紫杉醇奈達(dá)鉑 +紫杉醇奈達(dá)鉑 +多西紫杉醇MMT 比

27、色法測定不同加藥時間Western blotting 測細(xì)胞MMT 比色法測定不同用與順序?qū)?xì)胞的抑制率的影響Caspase-3蛋白表達(dá)藥方案下細(xì)胞抑制率分析對比不同情況下藥物對宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制作用篩選最佳組合方案圖 2聯(lián)合用藥及單藥用藥方案7材料與方法3.1 實驗材料人宮頸癌細(xì)胞系（ Caski）細(xì)胞由南華大學(xué)腫瘤研究所提供。受試對象本論文課題的實驗受試物為5種化療藥物順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇以及多西紫杉醇，均由南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科陳忠東教授惠贈。主要試劑表 1主要試劑及其生產(chǎn)單位信息序號試劑名稱生產(chǎn)單位1胰蛋白酶美國 Gibco 公司2新生小牛血清杭州四季清公司3RPMI-16

28、40 培養(yǎng)液美國 Gibco 公司4二甲基亞砜（ DMSO ）Sigma公司產(chǎn)品5順鉑山東齊魯制藥廠6卡鉑山東齊魯制藥廠7奈達(dá)鉑山西振東泰盛藥業(yè)8紫杉醇山西奧賽康藥業(yè)9多西紫杉醇山西奧賽康藥業(yè)10噻唑藍(lán)（ MTT ）美國 Gibco 公司產(chǎn)品11硝醋纖維素膜上海華舜生物工程有限公司12western-blotting 熒光檢測試劑盒北京中杉金橋生物技術(shù)公司13Caspase-3兔抗人多 g隆抗體EPITOMICS 生物技術(shù)公司14細(xì)胞裂解液、 PMSF上海碧云天生物技術(shù)研究所155蛋白上樣緩沖液上海碧云天生物技術(shù)研究所8主要儀器設(shè)備表 2使用的主要儀器設(shè)備及其生產(chǎn)單位信息序號儀器設(shè)備生產(chǎn)單位1

29、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱美國 SHEL-LAB 公司2普通離心機上海安亭科學(xué)儀器廠3超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備公司4超低溫冰箱SANYO 公司5光學(xué)顯微鏡Nikon 公司6電子天平上海天平儀器廠7恒溫震蕩搖床哈爾濱東聯(lián)電子廠 HZS-H8數(shù)控低溫高速離心機SANYO 公司9Heto-Holten 冷水循環(huán)儀丹麥 Heto-Holten 公司10去離子水純水儀UVP 公司11全自動酶標(biāo)儀BIO-RAD 公司12Eppendorf 加樣器Eppendorf 公司13制冰機SANYO 公司 SIM-F12414電熱恒溫干燥箱天津市泰斯特有限公司15倒置顯微鏡Olympus 公司16-20冰箱SANYO 公司1

30、7Bio Rad 聚丙烯酰胺垂直電泳USA 公司生產(chǎn)18凝膠圖像分析系統(tǒng)美國 UVP 公司主要試劑 配制 RPMI-1640 培養(yǎng)液：在 1000ml去離子水中加入 RIPM-1640培養(yǎng)基 10.4g，NaHCO3 碳酸氫鈉鹽 2.0g，攪拌 30min使其充分溶解，再用鹽酸調(diào)整PH值（位于 7.0 7.2）， 0.22 m孔徑的濾膜抽濾除菌，4冰箱保存。 10%小牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)基：使用前，先將新生小牛血清放入56水9浴 30min 滅活， 再加入 RPMI-1640 培養(yǎng)液，配制成 含 10% 小牛血 清的RPMI-1640培養(yǎng)基。配制 0.25%胰酶：用電子天平秤取 0.

31、25g的胰蛋白酶粉加入到 100mlPBS溶液中，并使其充分溶解。 再在超凈工作臺內(nèi) 0.22 m孔徑微孔濾膜過濾， -20 冰箱保存。配制 PBS：將 8.0g(NaCl)； 1.44g磷酸氫二鈉（ Na2HPO4 ）； 0.24g磷酸二氫鉀（ KH 2PO4）； 0.2g氯化鉀（ KCl ）加入到 800ml 雙蒸水中，充分溶解后，加雙蒸水定容 1000ml。分裝到 250 ml 潔凈的玻璃鹽水瓶中，蓋上膠帽并插上針頭，高壓消毒。 4冰箱保存。配制凍存液：按照無菌甘油：滅活小牛血清： 10%小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液 =1： 2：7比例配制，再在超凈臺內(nèi)經(jīng)過 0.22 m微孔濾

32、膜過濾， 4 保存。1.5MTris Cl：在 50ml雙蒸水中加入 18.165g Tris base，使其充分溶解，并定容至 100ml，濃鹽酸調(diào)整 PH值為 8.8，常溫下保存。30聚丙烯酰胺： 在60ml雙蒸水中加入丙烯酰胺 Acr 29g，N，N-亞甲雙丙烯酰胺 Bic 1.0g，在 37左右下充分溶解，使 PH值 7.0，再定容至 100ml，避光保存。10SDS： 將10gSDS加入到 10ml10蒸餾水中， 50水浴中使其充分溶解，再調(diào)整 PH值為 7.2，常溫下保存。1MTris Cl： 將電子天平稱量的 Tris base 6.055g加至 30ml蒸餾水中，使其充分溶解后

33、，定容為 50ml，調(diào)整 PH值至 6.8，4冰箱保存。轉(zhuǎn)移緩沖液：在 500ml蒸餾水中加入 SDS0.37g、甘氨酸 2.9g、Tris base5.8g，再加入甲醇 200Ml ，定容至 1000ml，常溫下保存。電泳緩沖液：在 800ml蒸餾水中加入甘氨酸 94g、Tris base15.1g，再加入配制好的 10SDS 50 ml，使 PH值為 8.3，定容 1000ml，常溫下保存。上樣緩沖液：在 200ml蒸餾水中加入稱好的 Tris base1.514g，使 pH值調(diào)整為6.8，再加入 0.25g溴酚藍(lán)， 5.0gSDS，在 50水浴中充分溶解后，加25ml甘油，使容積為 50

34、ml，在常溫下保存。?TBST緩沖液：在 800ml蒸餾水中加入 18.0gNaC， 2.42gTris base，定容至101000ml，使 pH值為 7.6，常溫下保存。使用前加入1.0mlTween。洗膜液配制：將 2.922g氯化鈉 NaCl ，溶于 50ml 蒸餾水中，再加入冰乙酸3.0ml，定容至 100ml，室溫下保存。封閉液：即 5%脫脂奶粉，使用前，將 1g脫脂奶粉，溶于 20ml TBST 緩沖液中。配制定影劑：在 50水浴中預(yù)熱 250ml去離子水，再加入定影粉，避光保存。配制顯影劑：在 50水浴中預(yù)熱 250ml去離子水，再加入顯影粉，避光保存。3.2 實驗方法復(fù)蘇宮頸

35、癌 Caski 細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞凍存記錄，將細(xì)胞迅速從-80冰箱或液氮內(nèi)取出，放入已經(jīng)預(yù)熱的 37水浴池內(nèi)， 將凍存管在水中不斷搖動， 快速解凍。約 1-2 分鐘液體完全溶解，75%的酒精棉球消毒凍存管，再移放入紫外線消毒的超凈臺內(nèi)。將細(xì)胞吸入離心管，再加入 10ml 培養(yǎng)液，混勻后離心， 1000 轉(zhuǎn)/分，離心 5 分鐘。離心后棄掉上清液，重新加入培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液。 將適量細(xì)胞懸液分裝到培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入 37， 5%二氧化碳和 95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2-4 小時后換培養(yǎng)液一次。將細(xì)胞放入 -80 攝氏度冰箱或液氮內(nèi)保存。宮頸癌 Caski 細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌 Caski細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，

36、生存條件為37下， 5%CO2和 95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中；使用的培養(yǎng)基為10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約 80%時開始傳代。在紫外線消毒好的超凈臺內(nèi)傳代， 小心吸出廢舊培養(yǎng)液，用預(yù)熱的 PBS清洗培養(yǎng)瓶細(xì)胞面 1-2次，加入適量胰蛋白酶消化細(xì)胞，以剛好蓋過細(xì)胞面最好。在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，細(xì)胞間間隙變大不再連成片后，再加入新的培養(yǎng)基終止消化， 并開始吹打細(xì)胞， 制成細(xì)胞懸液， 將細(xì)胞分裝至 2-3個培養(yǎng)瓶中，并做好標(biāo)記。酒精棉球消毒后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中。比色法檢測 5 個單藥的增殖抑制率11（1）受試對象：體外培養(yǎng)人宮頸癌Caski 細(xì)胞系細(xì)胞（2）被試因素

37、：順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、多西紫杉醇（3）實驗分組：將順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、多西紫杉醇分別設(shè)為1-5組，每組設(shè) 5 個復(fù)孔。溶媒對照組：含 0.1% DMSO 的培養(yǎng)液；空白對照組：完全培養(yǎng)液（含10%的小牛血清）；4）操作步驟：收集對數(shù)生長期的宮頸癌 Caski細(xì)胞，將細(xì)胞吹打均勻制成細(xì)胞懸液， 然后吸取少許懸液沿著蓋玻片邊緣緩慢滴入，使懸液慢慢充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，注意蓋玻片下不能產(chǎn)生氣泡，也不能使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。將計數(shù)板放到低倍鏡下觀察，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四個大格中細(xì)胞數(shù)（壓線細(xì)胞只算左側(cè)和上方的，細(xì)胞團按單個細(xì)胞計算） 。按照以下公式計算細(xì)胞密度： 細(xì)胞

38、懸液的細(xì)胞數(shù) /ml= 四個大格細(xì)胞總數(shù) /4X10 4，調(diào)整細(xì)胞懸液密度， 鋪板使待測細(xì)胞密度至 5000個/孔左右（邊緣孔用無菌PBS填充）。5%CO2、37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（ 96孔板），細(xì)胞貼壁約 2小時后加入順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、多西紫杉醇的藥物各 100l，各組藥物的濃度分別為 0.01 g/ml、0.1 g/ml 、1 g/ml 、10 g/ml 、100 g/ml、1000g/ml。每種藥物設(shè) 5個復(fù)孔。 5%CO2、 37孵育 48小時，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入0.5%MTT 溶液20l，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時。 終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液。 每孔加入 150l二

39、甲基亞砜，置搖床上低速震蕩 10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀 OD570nm處測量各孔的吸光值 (OD)。按下列公式計算抑制率（ IR）：IR=（對照組 OD值 -實驗組 OD值） /對照組 OD值x100%。再根據(jù)各復(fù)孔的抑制率，分別計算各組各濃度下的平均抑制率。比色法檢測聯(lián)合用藥組的增殖抑制率（1）受試對象：體外培養(yǎng)人宮頸癌Caski 細(xì)胞系細(xì)胞（2）被試因素：紫杉醇、多西紫杉醇、卡鉑、奈達(dá)鉑、順鉑12（3）實驗分組1） 不同用藥方案的析因設(shè)計擬研究的因素水平：紫杉烷和鉑類兩類藥物，分別用A、B 表示。其中 A類藥物包括三種情況：即A0 表示不加用任何紫杉烷藥物 ， A1表示

40、紫杉醇， A2表示多西紫杉醇； B 類藥物包括四種情況：即 B0 表示不加用任何鉑類藥物， B1表示卡鉑， B2 表示奈達(dá)鉑， B3 表示順鉑。將研究的各個分組設(shè)計方案列于表 1。表 3 34 析因設(shè)計紫杉烷（ A ）鉑類（ B）卡鉑組 (B1)奈達(dá)鉑組 (B2)順鉑組 (B3)不用鉑類（ B0 ）不用紫杉烷 (A0)對照組A0B1A0B2A0B3紫杉醇組 (A1)A1B0A1B1A1B2A1B3多西紫杉醇組 (A2)A2B0A2B1A2B2A2B3根據(jù)研究目的，該試驗設(shè)計共有 34=12 種處理，每單位處理組內(nèi)設(shè) 5 個復(fù)孔。其中， A0、 B0 表示溶媒對照組，含 0.1% DMSO 的培

41、養(yǎng)液；并設(shè)空白對照組，完全培養(yǎng)液（含 10%的小牛血清）。各組內(nèi)藥物濃度均取各自的 IC50 濃度值，劑量各取 100l 后混合（此時濃度為 1/2 IC50）；聯(lián)合用藥組采用同時加藥，觀察 48h 后測試結(jié)果。2） 不同加藥時間及順序的隨機單位組設(shè)計表 4隨機單位組設(shè)計加藥順序同時加藥A1+B1A1+B2A1+B3A2+B1A2+B2A2+B3先加紫杉烷 （A ） A1B1A1B2A1B3A2B1A2B2A2B3先加鉑類（ B）B1A1B2A1B3A1B1A2B2A2B3A2其中， A+B 表示 A 、B 同時加藥， AB 表示先加 A ，間隔 24h 后再加 B，BA表示先加 B，間隔 2

42、4h 后再加 A 。各組內(nèi)藥物濃度同樣取各自的IC50 濃度值，劑量各取 100l。同時加藥組觀察48h 后測試結(jié)果；間隔加藥組，第二次加藥后再觀察 24h 測試結(jié)果。（ 4）操作步驟收集對數(shù)生長期的宮頸癌Caski細(xì)胞，將細(xì)胞吹打均勻制成細(xì)胞懸液，然后吸取少許懸液沿著蓋玻片邊緣緩慢滴入，使懸液慢慢充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，注意蓋玻片下不能產(chǎn)生氣泡， 也不能使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。將計數(shù)板放13到低倍鏡下觀察， 當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四個大格中細(xì)胞數(shù) （壓線細(xì)胞只算左側(cè)和上方的，細(xì)胞團按單個細(xì)胞計算）。按照以下公式計算細(xì)胞密度：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù) /ml=四個大格細(xì)胞總數(shù) /4 104，

43、調(diào)整細(xì)胞懸液密度，鋪板使待測細(xì)胞密度至 5000個/孔左右（邊緣孔用無菌 PBS填充）。 5%CO2、37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（ 96孔板），細(xì)胞貼壁約 2小時后按分組加入藥物，每種藥物各 100l，濃度為各自 IC50值。間隔加藥組相隔 24小時，每組均設(shè) 5個復(fù)孔。步驟同上 MTT 比色法。判斷聯(lián)合用藥效應(yīng)：利用金氏公式25Q=E(a+b)/(Ea+Eb EaEb)判斷兩藥的合并用藥效應(yīng)。其中Ea、 Eb分別代表單藥抑制率，E(a+b)為兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制率，即實測合并效應(yīng)，分母Ea+Eb -EaEb 為期望合并效應(yīng)， Q為二者比值。當(dāng)Q0.05 時為明顯拮抗 ( )，0.05 Q0.

44、85 為拮抗 ()；當(dāng)0.85 Q 1.15時，合并效應(yīng)為相加 (+)， 1.15 Q 1.20為(+) ，Q1.20為(+)。實驗方法1）受試對象：體外培養(yǎng)人宮頸癌 Caski 細(xì)胞系細(xì)胞2）被試因素：順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、紫杉醇、紫杉醇（ 3）實驗分組： 1、DDP+TXL ，2、CBP+TXL ，3、 NDP+TXL ，4、DDP+DXL ，5、CBP+DXL ，6、 NDP+DXL 。4）操作步驟用對數(shù)生長期的 Caski細(xì)胞實驗。將生長狀態(tài)良好的宮頸癌 Caski細(xì)胞貼壁 6小時后換液，再分別按實驗分組加藥。 蛋白樣品制備：將培養(yǎng)液倒至 15毫升離心管內(nèi)，離心 2500 rpm5min

45、。棄掉上清液，加入 4ml PBS小心吹打洗滌，再2500 rpm5min離心一次；棄掉上清，加入 100l蛋白裂解液（按比例加入 PMSF 94：6，并且現(xiàn)配現(xiàn)用），冰上裂解30min。再將貼壁的細(xì)胞 PBS清洗兩次，盡量吸盡培養(yǎng)瓶里的 PBS，將培養(yǎng)瓶倒立于濾紙上吸干 PBS；加入裂解液冰上放置約 1015min。用刮匙將細(xì)胞刮至培養(yǎng)瓶一角，在冰中放置 30min。將前面加入裂解液的培養(yǎng)液與培養(yǎng)瓶中的混合在一起，吸取已裂解的細(xì)胞到EP管中，再在4下離心12000rpm8 10min，吸出上清液，即為細(xì)胞總蛋白，在-20下進行保存，14并用 BCA 法進行蛋白定量。 灌膠與上樣：先加入 8m

46、l分離膠，凝固后再加入 5ml積層膠，待膠凝固后捏住梳子的兩邊，豎直輕輕將梳子拔出，用蒸餾水清洗上樣孔；等量的蛋白加入等體積 5SDS蛋白緩沖液； 電泳：用 80V 電壓電泳約 30min ，待 Mark 達(dá)到兩膠交界處后將電壓調(diào)節(jié)至120V，待溴酚藍(lán)剛跑出后終止電泳； 轉(zhuǎn)膜：裁剪 6張濾紙及 1張合適大小的硝酸纖維素膜，視蛋白分子量定轉(zhuǎn)膜時間約 1小時； 封閉：膜用含 50mg/ml BSA 的TBST 封閉 2小時； 一抗反應(yīng)：加一抗稀釋液，在4下孵育過夜； 二抗反應(yīng)：加相應(yīng)的二抗稀釋液，用PBST漂洗 4次，每次 10min，于室溫下孵育 1小時； 壓片：先用 PBST清洗 3次，每次約

47、 10min。進入暗室后再用發(fā)光劑顯色，曝光，膠條壓片； 定影，顯影，水洗；觀察結(jié)果：顯示條帶的膠片行灰度掃描，再用軟件計算相關(guān)值，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。3.3 統(tǒng)計學(xué)處理各組實驗數(shù)據(jù)中，計量資料以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差 ( XS )表示；用軟件SPSS13.0計算 IC50 值；不同用藥方案的對比采用 34 析因設(shè)計資料的多因素方差分析；不同加藥實際及順序的對比采用隨機單位組設(shè)計資料的單因素方差分析；以P0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計結(jié)果均在軟件SPSS13.0 中完成。15實驗結(jié)果4.1 MTT 比色法檢測各單藥對宮頸癌Caski 細(xì)胞的體外藥敏試驗結(jié)果五種單藥在不同濃度下的對宮頸癌Caski

48、細(xì)胞的平均抑制率根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測儀 OD570nm 處所檢測到的各孔的吸光值 (A) ，計算抑制率（ IR）： IR=（對照組 A 值 -實驗組 A 值） /對照組 A 值 100%。再根據(jù)各復(fù)孔的抑制率，分別計算得到各組各濃度下的平均抑制率（表5 ）。該結(jié)果還表明五種藥物在體外對宮頸癌Caski 細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用， 并成劑量依賴性（圖3）。表 5不同藥物不同濃度下的抑制率(n=5, XS )濃度（ g/ml ）抑制率（ %）紫杉醇組卡鉑組奈達(dá)鉑組順鉑組多西他賽組0.014.93 1.023.68 1.265.00 1.217.20 1.411.00 0.120.1013.982.2

49、212.761.1214.133.3417.035.445.98 2.471.0032.554.0333.973.8434.983.2237.245.8325.824.5810.0054.656.8552.385.7558.747.3959.026.4749.127.58100.0075.875.5372.974.4478.596.4886.404.3469.047.931000.0085.505.9983.357.4787.096.4295.002.3375.906.53圖 3五種藥物在不同濃度下對宮頸癌Caski 細(xì)胞的平均增殖抑制率16五種單藥的體外藥敏試驗結(jié)果根據(jù)各單藥不同濃度下的平均

50、抑制率結(jié)果，采用“正規(guī)機率單法 ”，由軟件SPSS13.0算出五種單藥的 IC50 濃度，如表 4 所示。該試驗結(jié)果表明各單藥在體外對宮頸癌 Caski 細(xì)胞的敏感性由高到低順序為：順鉑奈達(dá)鉑紫杉醇卡鉑多西紫杉醇。表 6各單藥在體外對宮頸癌Caski 細(xì)胞的 IC50 濃度藥物名稱紫杉醇卡鉑奈達(dá)鉑順鉑多西紫杉醇IC50( g/ml)8.2510.295.904.0923.004.2 MTT 比色法檢測聯(lián)合用藥組的增殖抑制率不同聯(lián)合用藥方案所得結(jié)果比較分析不同用藥方案下對宮頸癌Caski 細(xì)胞的平均抑制率見表7，通過 34 析因設(shè)計方案的方差分析結(jié)果見表8，合并效應(yīng)結(jié)果見表9。研究發(fā)現(xiàn)： 1)不

51、同紫杉烷類藥物之間的抑制率不同（P0.05）； 2) 不同鉑類藥物之間的抑制率不同（ P0.05）； 3）紫杉烷類與鉑類藥物聯(lián)合用藥存在交互作用（ P0.05），且聯(lián)合用藥抑制率均高于單獨用藥（ P0.05）。其中，卡鉑 +紫杉醇組、順鉑 +紫杉醇組、奈達(dá)鉑 +紫杉醇組聯(lián)合用藥對宮頸癌 Caski 細(xì)胞的抑制率均顯著高于卡鉑 + 多西紫杉醇、奈達(dá)鉑 +多西紫杉醇、順鉑 +多西紫杉醇組（ P0.05）。表 7不同用藥方案下的細(xì)胞增殖抑制率(% ， n=5,XS )鉑類（ B）紫杉烷（ A ）不用鉑類（ B0 ）卡鉑組 (B1)奈達(dá)鉑組 (B2)順鉑組 (B3)不用紫杉烷 (A0)23.40 1.

52、7824.94 2.3524.401.37紫杉醇組 (A1)24.12 1.8654.60 1.16 a58.62 0.69a60.580.66a多西紫杉醇組 (A2)23.20 1.4846.64 3.7741.18 0.5843.020.54注： a： P0.05 ，分別與 A2B1 、A2B2 、 A2B3 組比較17表 8 3 4 析因設(shè)計方差分析結(jié)果變異來源SSDFMSFP紫杉烷 A10078.95325039.4771812.8170.05鉑類 B7702.30932567.436923.5670.05紫杉烷 *鉑類 B521.798686.96631.2840.05誤差133.4

53、36482.780總93604.1496表 9 不同聯(lián)合用藥方案下的 Q值及合并效應(yīng)鉑類（ B）紫杉烷（ A）卡鉑組 (B1)奈達(dá)鉑組 (B2)順鉑組 (B3)紫杉醇組 (A1)1.30 (+)1.36 (+)1.42 (+)多西紫杉醇組 (A2)1.13 (+)0.97 (+)1.03(+)注： Q=E (a+b)/(E a+Eb Ea*E b)判斷兩藥的合并用藥效應(yīng)。其中Ea、 Eb 分別代表單藥抑制率，E(a+b) 為兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制率，即實測合并效應(yīng)，分母Ea+Eb-Ea*E b 為期望合并效應(yīng)，Q為兩者比值。當(dāng) Q 0.05為明顯拮抗 ( )， 0.05 Q 值 0.85為拮抗 (

54、 )， 0.85 Q值 1.15 時，合并效應(yīng)為相加(+) ， 1.15 Q值0.05），見表 10。說明，在體外情況下改變聯(lián)合用藥時的加藥順序?qū)m頸癌Caski 細(xì)胞的體外抑制率無明顯影響。表 10不同加藥時間與順序下細(xì)胞增殖抑制率的對比(%， n=5, X S )用藥組合A1-B1A1-B2A1-B3A2-B1A2-B2A2-B3同時加藥54.60 1.1658.62 0.6960.58 0.6646.64 3.7741.18 0.5843.02 0.54先加紫杉烷（ A ）55.23 2.6860.32 1.6758.45 1.2147.38 2.3243.42 2.4441.34 2.

55、33先加鉑類（ B） 53.74 2.8859.56 2.0560.43 0.9845.33 2.9941.67 1.4344.23 2.63P0.0518圖 4聯(lián)合用藥時不同加藥順序之間抑制率的對比4.3 Western blotting法檢測聯(lián)合用藥組caspase-3的表達(dá)Western blotting 檢測顯示： 6 組聯(lián)合用藥組與空白對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P0.05)，多西紫杉醇聯(lián)合順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑三種方案比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P0.05)；紫杉醇聯(lián)合三種鉑類與多西紫杉醇聯(lián)合三種鉑類相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P0. 01)( 圖 5 ，表 11)。提示：對于宮頸

56、癌Caski 細(xì)胞，紫杉醇與三種鉑類的聯(lián)合方案促凋亡作用強于多西紫杉醇聯(lián)合三種鉑類；1 組：順鉑 +紫杉醇； 2 組：卡鉑 +紫杉醇； 3 組：奈達(dá)鉑 +紫杉醇； 4 組：順鉑 +多西紫杉醇；5 組：卡鉑 +多西紫杉醇； 6 組：奈達(dá)鉑 +多西紫杉醇。Cont123456caspase-3-actin圖 5聯(lián)合用藥各組caspase-3的表達(dá)情況19表 11 Western blotting檢測各組蛋白相對值比較(n=6, X S )分空白123456組ContDDP+TXLCBP+TXLNDP+TXLDDP+DXLCBP+DXLNDP+DXLRD5.5056.0715.3123.9483.5

57、902.9881.000 00.102 a0.312 a0.4150.7130.5820.231a注： 1、2、 3 組與 4、 5、6 組比較有顯著性差異（p0. 05）；但 b a 期 NACT 組的 5 年無瘤生存率高于 CO 組為 77.1%和 64. 3% （ P0. 05），他們研究認(rèn)為多數(shù)宮頸癌患者對 NACT 是有反應(yīng)的。但也有學(xué)者提出了不同的結(jié)論， GOG（Gynecologic Oncology Group ）16 對 288 例32FIGO 分期為 A 期前的宮頸癌患者，行新輔助化療+宮頸癌根治術(shù)與單純行根治術(shù)治療的患者進行比較， 結(jié)果顯示兩組間死亡率和復(fù)發(fā)率相近，說明新

58、輔助化17療對其預(yù)后沒有明顯影響。 一項大規(guī)模的薈萃分析表明，對于 FIGO 分期為B1 期-A 期的患者，術(shù)前應(yīng)用新輔助化療和直接行外科手術(shù)的相比，新輔助化療患者瘤體縮小、 局部及遠(yuǎn)處淋巴轉(zhuǎn)移少、 術(shù)后行輔助放療率低， 但是其總生存期未見明顯改善。因此NACT 做為標(biāo)準(zhǔn)治療方案得到推廣，還需要更多的臨床（ 2）放療前新輔助化療有學(xué)者認(rèn)為，放療前行 NACT 可以通過減少腫瘤體積及降低乏氧從而增加放療的敏感性。 但是在放療前行 NACT ，在各期宮頸癌患者中療效均不肯定。一項隨機分組研究證明，行 NACT+ 放療組臨床緩解率較放療組高，但是總生存率無增加，并且行新輔助化療的很多患者出現(xiàn)急性毒副

59、反應(yīng) 18 。Tierney19 對隨機研究的 2074 例患者進行薈萃分析，說明行新輔助化療 +放療的患者并不比單純放療更有優(yōu)勢，但是行 NACT 后行放療，在高劑量強度順鉑和短周期時似乎有效。在 2012 年中國宮頸癌防治工程學(xué)術(shù)年會上， 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院高雨農(nóng)教授認(rèn)為 , 雖然所有的結(jié)果都不支持放療前給予局部晚期宮頸癌以鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療，但指出從兩方面可以提高長期生存率： 放療前行以鉑為基礎(chǔ)的短療程和密集劑量的化療；術(shù)前（放療或無放療）的新輔助化療。（ 3）特殊時期的新輔助化療孕期診斷為早期宮頸癌又強烈要求繼續(xù)妊娠的患者，在足月前盡量延長孕周為主要宗旨。新輔助化療在穩(wěn)定及延緩疾病進展

60、、 延長孕周及獲得存活胎兒等方面均被認(rèn)為是可行的。有文獻報道 20，26 歲孕婦、三胎妊娠以及孕 18 周時被診斷為宮頸透明細(xì)胞癌， 根據(jù) FIGO 分期為 B1 期，磁共振成像評估腫瘤后予以3個周期的新輔助化療，并于32 周行剖宮產(chǎn)及根治性子宮切除，術(shù)后病理診斷證實為透明細(xì)胞腺癌 B1 期；術(shù)后進行 36 個月的隨訪， 母親和新生兒沒有相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生。 Cardonick 等21 對 376 例孕期行新輔助化療的患者研究表明，新生兒及胎兒死亡率分別為1%和 5%，早產(chǎn)為 5%，胎兒生長受限為7%。分娩宜選在化療后 3 4 周，利于母體恢復(fù)，同時通過胎盤清除胎兒體內(nèi)由化療引起的毒性殘留。盡管上