齊全版(熒光PCR技術)課件

1、實時熒光定量PCR技術一、熒光定量 PCR儀 熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統的PCR儀，通常配有電腦系統及相應的分析軟件。與普通PCR的區(qū)別（一）普通PCR技術： 在PCR結束后對終點產物進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數期對起始模板進行定量。起始定量與終點定量起始DNA量是“天然”的量，更有意義；終點DNA量是經過PCR“加工”，存在部分失真起點定量重現性好；終點定量誤差大由于PCR擴增效率的差異使得相同的樣品擴增結果存在很大的差異相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖實時熒光定量 PCR（real-time PCR)應用方法：通過熒光染料或

2、熒光標記的特異性探針,對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號，結合相應的軟件對結果進行分析，從而實現對起始模板定量及定性分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線實時熒光擴增曲線圖擴增曲線的描述PCR的擴增曲線實際上并不是一條標準的指數曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)數的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭，反應副產物焦磷酸對合成反應的

3、阻害等原因，致使PCR并非一直呈指數擴增，而最終將進入平臺期。熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段， PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，因此應選擇這個階段進行定量分析。 幾個定義線性基線期為擴展最初的1015個循環(huán)，此時，PCR反應處于起始階段，擴增產物很少，所產生的熒光信號很低

4、。什么是熒光域值（threshold）PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準差的10倍，即： threshold = 10 SDcycle 3-15 幾個定義定量的分類絕對定量方法：絕對定量方法相對簡單。絕對定量是使用已知濃度的標準品制作標準曲線，對未知濃度的樣本進行絕對量（拷貝數）測定的方法。相對定量方法：相對定量方法相對復雜，一般用于基因表達解釋。首先應分別測定目的基因和參比基因的量，再求出對應參比基因的目的基因的相對量，最后再進行樣品間相對量的比較。每一擴增周期后產物的量可以用下式表示定量PCR的數學原理y=x(1+e)ny

5、：產物分子數 x：起始分子數e：擴增效率 n：循環(huán)次數 內摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman探針 Taqman MGB 探針二、熒光定量PCR標記檢測類型熒光嵌合檢測法原理融解曲線：采用SYBR Green I熒光嵌合法檢測時，可以通過融解曲線分析，確認PCR反應的特異性。溶解曲線分析是在PCR反應結束后，將PCR反應液的溫度漸漸升高，實時監(jiān)測SYBR Green I的熒光信號強度變化進行的。起初由于PCR擴增產物呈雙鏈，具有較高的熒光信號強度，隨著溫度的漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA中的SYBR Green I數量減少，熒光信號強度就漸漸降低，當雙鏈DNA解

6、鏈一半時，熒光信號強度急劇下降，此時的溫度即融解溫度（Tm值），Tm值與PCR擴增產物的序列有關，對于某一PCR擴增產物，其值是固定的。融解曲線的分析理想的融解曲線應該只有單一峰型曲線。如果出現兩個或以上的峰型，說明有引物二聚體等非特異性擴增產生，需要對反應條件進行優(yōu)化或重新設計引物。優(yōu)點：成本較低，無須對引物或探針進行特殊的熒光標記，操作亦比較簡單 ，適合于篩檢。缺點：特異性不夠，染料分子會結合到非特異性擴增產生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應體系中的熒光本底較高 （SYBR Green I）標記的優(yōu)、缺點實時熒光PCR的理論基礎熒光共振能量轉移（FRET）：當一個熒光基團與一個熒光淬滅基團

7、（可以淬滅前者的發(fā)射光譜）的距離鄰近至一定范圍時，就會發(fā)生熒光能量轉移，淬滅基因會吸收熒光基團在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團一旦與淬滅基團分開，淬滅作用即會消失。所以，利用核酸雜交和核酸水解所致熒光基團和淬滅基團結合或分開的原理，建立各種實時熒光PCR。TaqMan Probe法TaqMan Probe法是使用5端帶有熒光物質（如：FAM等），3端帶有淬滅物質（如：TAMRA等）的TaqMan探針進行熒光檢測的方法。當探針完整時，5端的熒光物質受到3端的淬滅物質的制約，不能檢出熒光。而當TaqMan探針被分解后，5端的熒光物質便會游離出來，發(fā)出熒光。當PCR反應液

8、中加入熒光探針后，在PCR反應的退火過程中，熒光探針便會和模板雜交，進一步在PCR反應的延伸過程中，DNA聚合酶的53核酸外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質發(fā)出熒光，通過檢測反應體系中的熒光強度，可以達到檢測PCR產物擴增量的目的，具體原理如下圖：TaqMan Probe法原理TaqMan探針水解型1.熒光素，淬滅劑2.FRET（熒光共振能量傳遞）3.識別特異性產物優(yōu)點對目標序列特異性高缺點1.只適用于一個目標（特異序列）2.價格較高（1000-2000元）3.探針5端不能是G（切下后淬滅）熒光化學監(jiān)測方式總結化學試劑工作原理有否淬滅劑主要應用范圍SYBR Green I結合

9、于雙鏈DNA的小溝中否熔解曲線分析定量和檢測目標基因TaqMan水解型雜交探針（5-3外切）有SNP分析定量和檢測目標基因TaqMan MGB 探針法原理在TaqMan探針的基礎上，進一步發(fā)展了MGB探針。在它的3端連接的不是通常的TAMRA淬滅基團，而是一種非熒光淬滅劑（NFQ），其3還有一種小溝結合分子，即MGB探針，該分子折疊進入dsDNA小溝，從而使探針和模板緊緊結合。MGB探針在檢測SNP和定量分析甲基化等位基因方面具有優(yōu)勢。TaqMan MGB 探針法TaqMan MGB 探針能分辨一個堿基的差別TaqMan MGB 探針法原理圖示優(yōu)點：1.NFQ為非熒光基團，大大降低測定中熒光的

10、本底值，有提高了淬滅效率。2.MGB結合在探針與靶基因雜交形成的雙螺旋的小溝中，促進探針與靶基因雜交的穩(wěn)定性和特異性，又使探針的Tm值大大提高，從而使雜交溫度的選擇余地更大。缺點：1.合成TaqMan探針價格昂貴。（一條探針約30005000元）2.中國地區(qū)僅有基康生物公司（ABI）提供合成服務，合成時間長，周期需要12個月.與TaqMan探針相比，MGB探針長度更短，淬滅效率更高。案例分析1.應用SYBR Green I 熒光實時定量PCR檢測成蚊攜帶的登革病毒。2. 應用TaqMan探針技術進行SNP分析應用SYBR Green I 熒光實時定量PCR檢測成蚊攜帶的登革病毒。1.對成蚊與標

11、準品進行前處理，提取RNA2.將成蚊樣品與標準品的RNA逆轉錄成CDNA3.使用一系列稀釋的已知濃度的標準品CDNA作為模板，通過SYBR Green I 熒光定量PCR進行擴增，繪制標準曲線。4.以成蚊樣品的CDNA為模板，應用熒光PCR檢測其Ct值。SYBR Green I熒光PCR實驗材料：1.一對特異性引物（1530bp）（約4060元）2. SYBR Premix EX Taq II 試劑盒（mix）（大連寶生物價格：1700元，50ul規(guī)格200次反應）3.CDNA模板（標準品，成蚊樣品）X0=(1+Ex) *Ct+YTaqMan探針技術進行SNP分析SNP（單核苷酸多態(tài)性）1.人類基因組中的單堿基突變2.大約93%的基因至少含有一個SNPSNP分型的意義1.可能引起疾病或疾病的易感性2.作為基因缺陷型疾病的標志物3.SNP的漂變可作為進化研究手段4.藥物的抗藥性研究CYP2D6細胞色素P450酶家族成員負責大約20普通藥物代謝在人類中該基因序列變異較多TaqMan熒光PCR實驗材料：1.一對特異性引物（1530bp）2.兩條熒光探針（每條探針，2OD,約10002000元）2. Premix EX Taq 試劑盒（mix）（大連寶生物價格：2000元，50ul規(guī)格200次反應）3.CDNA模板實驗設計基因