病毒感染的實驗室課件

1、第23章 病毒感染的實驗室 診斷技術(shù) 1第23章 病毒感染的實驗室1第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運送第二節(jié) 病毒形態(tài)學(xué)檢查第三節(jié) 病毒的分離與鑒定第四節(jié) 病毒的血清學(xué)檢測第五節(jié) 病毒的分子生物學(xué)檢測第六節(jié) 病毒感染的快速診斷主 要 內(nèi) 容 THE END 2第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運送主 要 內(nèi) 容 THE一、標(biāo)本的采集、處理第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運送 （一）采集樣本的時間 在發(fā)病初期（急性期）采取較易檢出病毒，越遲陽性率越低。 （二）標(biāo)本種類的選擇 1.呼吸道感染 2.腸道感染 3.中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染 4.其他感染 3一、標(biāo)本的采集、處理第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運送 （一）采1血液 2糞

2、便標(biāo)本 3尿道拭子及尿液標(biāo)本 4鼻拭子和咽拭子 5喉拭子 6含漱液標(biāo)本 （三）常見標(biāo)本的采集方法和用途 7腦脊液標(biāo)本 8眼拭子標(biāo)本 9宮頸或陰道拭子 10皰疹液標(biāo)本 11各種活檢和尸檢標(biāo)本41血液 （三）常見標(biāo)本的采集方法和用途 7腦脊液標(biāo)本 41血液標(biāo)本 2糞便標(biāo)本 3鼻、咽拭子標(biāo)本 4尿標(biāo)本 5皰疹液 6腦脊液 7組織標(biāo)本 （四）標(biāo)本的處理 51血液標(biāo)本 （四）標(biāo)本的處理 5病毒的抵抗力通常較弱，在室溫下很快滅活，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送到病毒實驗室，如實驗室距離較遠(yuǎn)或一時無法立即傳送時，應(yīng)將標(biāo)本放入裝有冰塊的冰壺內(nèi)盡快送檢。大多數(shù)病毒對甘油有抵抗力，送檢的組織、糞便標(biāo)本等可置于含抗生素的50%

3、甘油緩沖鹽水中，低溫下保存送檢。最好在標(biāo)本采取后12h內(nèi)送到實驗室，立即進(jìn)行檢查或分離培養(yǎng)。暫時不能檢查或分離培養(yǎng)時，應(yīng)將標(biāo)本放入凍存液并加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）以防止反復(fù)凍溶使病毒滅活，存放在-70低溫冰箱內(nèi)保存。 二、標(biāo)本的運送和保存 6病毒的抵抗力通常較弱，在室溫下很快滅活，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送到一、形態(tài)學(xué)檢查 （一）光學(xué)顯微鏡 （二）電子顯微鏡檢查法 1、電鏡直接檢查法 2、免疫電鏡檢查法 （三）X線晶體衍射法 第二節(jié) 病毒形態(tài)學(xué)檢查 7一、形態(tài)學(xué)檢查 第二節(jié) 病毒形態(tài)學(xué)檢查 7（一）電子顯微鏡直接測量 （二）超過濾法 （三）超速離心法 二、病毒大小的測定 8（一）電子顯微鏡直接

4、測量 二、病毒大小的測定 8一、病毒分離和鑒定的一般程序 第三節(jié) 病毒的分離與鑒定 臨床標(biāo)本的收集標(biāo)本處理后接種新生小鼠組織雞胚收獲尿囊液、羊膜腔液紅細(xì)胞凝集試驗CPE紅細(xì)胞吸附空斑試驗包涵體EM觀察發(fā)病9一、病毒分離和鑒定的一般程序 第三節(jié) 病毒的分離與鑒定 臨（一）病毒分離培養(yǎng) 1動物接種二、病毒的分離與鑒定 2雞胚培養(yǎng)10（一）病毒分離培養(yǎng) 二、病毒的分離與鑒定 2雞胚培養(yǎng)103組織培養(yǎng) （1）原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) （2）二倍體細(xì)胞培養(yǎng) （3）傳代細(xì)胞培養(yǎng) （4）病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 1）細(xì)胞病變 2）紅細(xì)胞吸附（hemadsorption） 3）干擾現(xiàn)象 4）細(xì)胞代謝的改變 113

5、組織培養(yǎng) 11 （二）病毒的數(shù)量與感染性測定 1蝕斑（plaque）測定 蝕斑形成單位（plaque forming unit, PFU） 250%感染量或50%組織感染量（ID50或TCID50）測定 （三）新分離病毒的鑒定 1病毒核酸類型的測定 2理化性狀的檢測：大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對稱類型、有無包膜等 3血清學(xué)鑒定 12 （二）病毒的數(shù)量與感染性測定 250%感染量或50%一、中和試驗 （一）原理 （二）用途 第四節(jié) 病毒的血清學(xué)檢測 二、補體結(jié)合試驗 （一）原理 （二）用途 13一、中和試驗 第四節(jié) 病毒的血清學(xué)檢測 二、補體結(jié)合試驗 三、血凝及血凝抑制試驗 （一）原理 （二）用途 四、凝

6、膠免疫擴散試驗 （一）原理 （二）用途 14三、血凝及血凝抑制試驗 四、凝膠免疫擴散試驗 14一、分子雜交技術(shù) （一）基本原理 （二）主要步驟 樣品處理、探針的制備 、預(yù)雜交 、雜交 、漂洗、檢測（三）常用的雜交方法 1斑點雜交(spot b1ot hybridization) 2固相雜交技術(shù) 3原位分子雜交（in site hybridization） 4Southern印跡和 Northern印跡法 5分支DNA（branched DNA, bDNA）技術(shù) 第五節(jié) 病毒的分子生物學(xué)檢測 15一、分子雜交技術(shù) 第五節(jié) 病毒的分子生物學(xué)檢測 15二、聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase cha

7、in reaction, PCR） （一）基本原理 （二）主要步驟 1.模板的制備 2.反應(yīng)體系的組成：緩沖液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、模板 3擴增： 變性復(fù)性 延伸 4產(chǎn)物分析（三）常用技術(shù) 巢式（nested）和半巢式（hemi-nested）PCR、原位PCR（site PCR）、逆轉(zhuǎn)錄PCR（revere transcriptive PCR, RT-PCR） 、多重PCR（multiple PCR）、RNA捕獲PCR(RNA captured PCR)、免疫PCR（immune PCR）、定量PCR（ration PCR） 16二、聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain rea三、凝膠電泳技術(shù) （一）基本原理 （二）常用方法 1瓊脂糖凝膠電泳 2聚丙烯酰胺凝膠電泳 17三、凝膠電泳技術(shù) 17一、形態(tài)學(xué)檢查 二、病毒抗原的檢測