乳酸菌對沙棘汁中酚酸及揮發(fā)性化合物的影響研究

1、乳酸菌對沙棘汁中酚酸及揮發(fā)性化合物的影響研究沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木，廣泛種植于我國西北地區(qū)。沙棘漿果富含大量天然營養(yǎng)物質1，沙棘果中富含酚類化合物、維生素、脂肪酸及植物甾醇等天然營養(yǎng)成分2。沙棘果還擁有一定的醫(yī)療潛力，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等特性3；并且對于一些慢性疾病有著積極作用，例如高脂血癥，2型糖尿病和心血管疾病4。然而沙棘果在采摘運輸過程中容易受到機械損傷，將其加工成果汁、濃縮汁等產品不僅可以方便運輸，還可以在一定程度上保留沙棘果中的營養(yǎng)成分。目前市場上的沙棘果汁產品的加工方式以添加蔗糖、甜味劑等簡單的糖酸比調節(jié)為主。產品附加值

2、不高，且對消費者吸引力不強5。乳酸發(fā)酵被認為是一種保持并提高果蔬營養(yǎng)價值及感官特性的加工方法6。未經加工的沙棘果汁pH為22.9，這是由于沙棘汁中含有大量以蘋果酸為主的有機酸7。而乳酸菌通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵可以將口感苦澀、具有刺激性酸味的蘋果酸轉化成口感柔和的乳酸8。此外，乳酸發(fā)酵還能提高果蔬汁的營養(yǎng)價值，F(xiàn)ENG等9研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以顯著提高枸杞汁的抗氧化能力，并且類黃酮、酚類等化合物也有所增加。ZHANG等10研究發(fā)現(xiàn)，通過植物乳桿菌發(fā)酵的藍莓汁酚類物質總量增加了43.42%，花青素含量提高了15.38%，且抗氧化能力也有所提高。PENG等11發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵對于蘋果濁汁的香氣成分也有

3、一定的改善。因此本研究選用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌復配對沙棘果汁進行發(fā)酵，通過液相色譜質譜聯(lián)用(liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry, LC-ESI-MS)、HPLC、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)等方法對發(fā)酵前后的酚酸、有機酸和揮發(fā)性化合物進行檢測，同時對發(fā)酵前后的抗氧化性進行測定并與酚酸進行相關性分析，以期為沙棘乳酸菌產

4、品的研制提供參考。1 材料與方法1.1 主要試劑、儀器和設備植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌，上海仙農生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸、冰乙酸、無水醋酸鈉、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine, TPTZ)、DPPH、ABTS(均為分析純)，天津市盛奧化學試劑有限公司；MRS固體培養(yǎng)基，海博生物技術有限公司；有機酸及酚酸標品(均為色譜級)，上海源葉生物科技有限公司；磷酸、甲醇、甲酸、乙腈、2-辛醇(均為色譜級)，上海麥克林生化科技有限公司。LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；8890-7000D氣象色譜三重四級桿質譜聯(lián)用儀，安捷倫

5、科技有限公司；T9S紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；WSC-S色差儀，上海精密科學儀器有限公司；Vanquish超高效液相系統(tǒng)、Q exactive高分辨質譜系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司。1.2 發(fā)酵沙棘汁的制備沙棘購自新疆石河子，儲存于(40.5) 的冷庫中。挑選成熟完整的沙棘用去離子水清洗以除去灰塵和表面雜質。將沙棘果與蒸餾水按料液比11(gmL)的比例打漿，然后使用40目篩網過濾雜質。為了給乳酸菌提供生長所用碳源和適宜的酸堿度，使用白砂糖和無水Na2CO3(食品級)將可溶性固形物含量和pH分別調整為10.0和6.0，之后在75 的水浴中巴氏殺菌20 min。將沙棘汁冷卻至

6、25 ，將混合乳酸菌粉m(嗜酸乳桿菌)m(植物乳桿菌)=11與無菌水以150(gmL)的比例混合，此時活菌數(shù)為1010CFU/mL，接著從中吸取0.07% (體積分數(shù))至沙棘汁中，在37 培養(yǎng)48 h。作為對照，將未接種菌粉的沙棘汁置于相同的條件下48 h。實驗組和對照組都為3次重復。1.3 理化指標的測定可溶性糖參照NY/T 27422022水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法測定；總酸參照GB 124562022食品安全國家標準 食品中總酸的測定pH電位滴定法測定；有機酸檢測方法參照GB 5009.1572022食品安全國家標準 食品有機酸的規(guī)定對酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳

7、酸進行測定。島津高效液相色譜系統(tǒng)，檢測器SPD-20A，色譜柱選用CAPECELL PAK MG S5 C18柱，4.6 mm250 mm,5 m。使用色差儀對沙棘汁的色差進行測定，使用白板和黑板將色差儀進行預熱校準，隨后稱取5 mL的樣品進行測定分析，試驗重復3次，最終結果取平均值12。1.4 抗氧化能力的測定總抗氧化能力用鐵離子還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)法13測定；參照文獻14的方法測定DPPH自由基清除活性；ABTS陽離子自由基清除活性參照文獻15的方法稍加修改后測定。所有實驗重復3次。1.5 酚酸的測定16采用LC-ESI-

8、MS分析方法對樣品中酚酸進行定性定量檢測，具體分析條件和分析方法如下：色譜條件：色譜系統(tǒng)采用超高效液相系統(tǒng)(Vanquish，Thermo，USA)，根據(jù)化合物的性質，采用Waters HSS T3(100 mm2.1 mm，1.8 m)液相色譜柱，進樣量2 L，柱溫40 。流動相A(0.1%甲酸-乙腈)，流動相B(0.1%甲酸-水)。梯度洗脫(02 min，A相10%，B相90%；28 min，A相60%，B相40%；812 min，A相10%，B相90%)。質譜條件：質譜系統(tǒng)采用美國Thermo公司的Q exactive高分辨質譜檢測系統(tǒng)，配有電噴霧(ESI)離子源和Xcalibur工作站

9、。采用電噴霧離子源(ESI)，分析物在負離子同時掃描下以單離子檢測(SIM)模式進行分析，該模式可以大大提高靈敏度。優(yōu)化的質譜分析條件如下：鞘氣40；輔助氣10；離子噴霧電壓+3 000 V；溫度 350 ；離子傳輸管溫度320 。1.6 HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性化合物分析17向20 mL頂空瓶中加入1 g NaCl，然后加入5 mL樣本和10 L 2-辛醇(1 000 g/L)。為吸附揮發(fā)性化合物，將萃取頭插入40 頂空瓶中40 min。然后，使用帶有HP-innowax (30 m0.25 mm0.25 m)毛細管柱的GC-MS (Agilent 8890-7000D)分析揮發(fā)性化

10、合物。起始溫度40 ，保持2 min，然后以3 /min升至85 ，再以1 /min升至105 ，然后以3 /min升至180 ，最后以10 /min升至230 ，保持5 min。與NIST2022和Wiley 8.0數(shù)據(jù)庫進行比較，通過質譜鑒定了樣本中的揮發(fā)性化合物，以2-辛醇為內標測定各化合物的量，不考慮揮發(fā)性化合物的回收率和響應因素，各種揮發(fā)性化合物定量分析如公式(1)所示：揮發(fā)性化合物提取量/(gL-1)=樣品質量(1)1.7 數(shù)據(jù)處理使用Origin 2022b及R軟件進行作圖，使用SPSS 25進行方差分析，P0.05表明差異顯著。2 結果與討論2.1 發(fā)酵前后理化指標的變化從表1

11、可看出，乳酸菌在沙棘果汁中生長良好，由可溶性糖、總酸、活菌數(shù)指標的變化可知復配乳酸菌可以很好地利用果汁中的碳源，對可溶性糖的利用率達到了42.4%，而可滴定酸含量增加了92%。據(jù)報道，乳酸菌對碳源的利用主要有兩條途徑：通過糖酵解(EMP)途徑產生乳酸，即乳酸菌在無氧條件下將碳源分解為丙酮酸，進而將丙酮酸還原為乳酸18；另一方面乳酸菌還可以通過蘋果酸-乳酸(malolactic fermentation,MLF)發(fā)酵途徑將蘋果酸脫羧形成乳酸，圖1為有機酸測定的總離子流色譜圖，對數(shù)據(jù)進行處理后得到有機酸的含量如表1所示。沙棘汁中的蘋果酸含量為6.45 g/L，發(fā)酵結束時的蘋果酸含量為2.34 g/

12、L，所以乳酸菌在沙棘汁中有良好的蘋果酸-乳酸轉化能力，通過蘋果酸-乳酸轉化可以將口感酸澀的蘋果酸轉化為柔和的乳酸，豐富了飲料的口感19。酒石酸則是水果中一種常見的有機酸，具有強烈的酸味，在乳酸發(fā)酵過程中通過酒石酸脫水酶的作用可以將酒石酸轉化為乳酸和CO2，也可以在一定程度上降低果汁中酸澀的口感。檸檬酸含量在發(fā)酵前后則無顯著差異(P0.05)。從理化指標可以看出，乳酸菌可以很好地改善沙棘汁的口感，并改變沙棘汁中的有機酸組成，同時活菌數(shù)也高于輕工標準QB/T 53562022果蔬發(fā)酵汁中規(guī)定的乳酸菌總數(shù)需1105CFU/mL的要求。為了進一步研究復配乳酸菌發(fā)酵對沙棘汁的影響，同時也對發(fā)酵前后的色差

13、值進行了測定，結果顯示發(fā)酵前后L*、a*及b*值有顯著差異，L*值的變化可能是因為乳酸菌的增殖，導致飲料的濁度增加從而引起L*值的下降，a*、b*在發(fā)酵后有明顯改變，這可能是因為乳酸菌的代謝作用將大分子的酚類物質分解成小分子物質，從而改變了飲料的顏色20。圖1 有機酸的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of organic acids表1 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice注：同

14、列不同小寫字母表示差異(P0.05);ND-未檢出(下同)2.2 抗氧化能力的測定水果是抗氧化劑的良好天然食物來源之一，抗氧化活性可以作為評價水果產品質量的標準之一21。對乳酸菌發(fā)酵前后沙棘汁的抗氧化能力、自由基清除能力進行了檢測，總抗氧化能力結果如表2所示，發(fā)酵沙棘汁(6.15 mmol/L)顯著(P0.05)高于沙棘汁(5.56 mmol/L)，發(fā)酵可顯著增強沙棘汁抗氧化能力。DPPH自由基清除活性試驗表明，相比于沙棘汁，發(fā)酵沙棘汁(82.2%)的DPPH自由基的清除能力提高了23.98%。ABTS陽離子自由基清除實驗結果顯示乳酸菌發(fā)酵沙棘汁為87.65%和沙棘汁為75.03%。相比未發(fā)酵

15、沙棘汁，發(fā)酵后的沙棘汁ABTS陽離子自由基清除能力提高了16.8%。有研究表明，乳酸菌飲料抗氧化能力的提高可歸因于酚類物質的變化22。為此，在后續(xù)的研究中對酚酸進行了檢測。表2 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice2.3 發(fā)酵前后的酚酸檢測結果酚酸測定的總離子流色譜圖如圖2所示，對數(shù)據(jù)進行處理得到酚酸的含量，從圖3可以看出，沙棘汁中主要的酚酸為：阿魏酸(36.17%)、香草酸(15.34%)、咖啡酸(12.95%)、沒食子酸(12.

16、79%)，而乳酸菌發(fā)酵沙棘汁中主要的酚酸分別為：阿魏酸(32.83%)、沒食子酸(30.9%)、咖啡酸(11.25%)。圖2 酚酸的總粒子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of phenolic acids發(fā)酵后沒食子酸和阿魏酸的含量都有顯著增加(P0.05)，其原因可能是在發(fā)酵過程中pH下降形成的酸性環(huán)境減緩了酚酸的氧化。乳酸菌水解酶也可以將復雜的多酚如植物細胞壁的多酚化合物通過水解形成小分子化合物的方式釋放出來，從而增加多酚物質的含量23。圖3 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁中酚酸含量的比較Fig.3 Comparison of phenolic acid c

17、ontent between sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice 注：不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)對酚酸與抗氧化性和色度進行了皮爾遜相關性分析，如圖4所示，其中沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸及總酚酸與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除能力呈顯著正相關(P0.05)，而與FRAP抗氧化能力呈顯著正相關的酚酸為沒食子酸、阿魏酸、肉桂酸及總酚酸。沒食子酸和阿魏酸是一種常見的抗氧化劑，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等病理作用，對心血管疾病也有一定的治療作用24。乳酸菌發(fā)酵對于咖啡酸的含量并沒有顯著影響。香草酸、丁香

18、酸、對羥基苯甲酸，水楊酸在發(fā)酵之后略有減少。這可能是由于乳酸菌代謝使得不穩(wěn)定的酚酸轉化成了其他物質。而發(fā)酵后沒食子酸及阿魏酸顯著增加(其中沒食子酸較發(fā)酵前增加了183%)，這可能是發(fā)酵后DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP抗氧化能力增加的原因之一。而對色度與酚酸的相關性分析結果顯示，所有酚酸均與L*、a*、b*的變化呈顯著(P0.05)相關，這說明發(fā)酵之后酚酸成分的變化是造成顏色改變的重要原因之一。圖4 酚酸與抗氧化能力及色度的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of phenolic acid with antioxidant activity

19、and chromaticity2.4 發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物測定結果本研究共鑒定出了41種揮發(fā)性化合物(其中沙棘汁32種，發(fā)酵沙棘汁36種)，包括29種酯類化合物、5種醛類化合物、3種醇類化合物、3種酮類化合物及1種酸類化合物。從圖5可知，3組平行試驗之間差異不大，這說明實驗的重復性較好，同時發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物成分差異較大且發(fā)酵后揮發(fā)性化合物濃度顯著增加。為了研究發(fā)酵前后香氣成分的差異，通過對化合物的濃度與嗅聞閾值的比值對香氣活度值(odor activity value,OAV)進行計算，OAV1的揮發(fā)性化合物被認為對風味具有貢獻，發(fā)酵前的沙棘汁中共2種OAV1的化合物，分別為：異戊酸乙酯

20、(類似蘋果、香蕉的香氣和酸甜氣味，OAV=23.38)、正己酸乙酯(水果香氣，OAV=4.30)，發(fā)酵后的沙棘汁中共5種OAV值1的化合物，它們分別為：丁酸乙酯(菠蘿香味，OAV=7.13)、異戊酸乙酯(OAV=29.08)、正己酸乙酯(OAV=6.19)、異戊酸異戊酯(水果香氣，OAV=1.23)、月桂酸乙酯(花生香氣，OAV=1.20)。乳酸菌發(fā)酵一定程度上改善了沙棘汁的風味；為了進一步分析發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物的變化，以揮發(fā)性化合物濃度為指標，使用正交偏最小二乘法判別分析(discriminant analysis of orthogonal partial least squares, OPLS-DA)對數(shù)據(jù)進行分析處理25。圖5 沙棘汁和發(fā)酵沙棘汁的揮發(fā)性化合物含量熱圖Fig.5 Heat map of volatile compounds content in sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juic