循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測原理及其應(yīng)用

1、循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測原理及其應(yīng)用知行合一、經(jīng)世致用Central South University01循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的背景與意義Background and significance of the topic02循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集原理及方法Principle and method of circulating tumor cell enrichment03循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定原理及方法Principle and method of identification of circulating tumor cells04CellSearch系統(tǒng)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用Contents.目錄自強(qiáng)不息 厚

2、德載物Tsinghua University of China01循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的背景與意義Background and significance of the CTCs知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityThomasAshworth在癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞體積和形態(tài)相似的細(xì)胞。他推測，這些細(xì)胞在癌癥轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了非常重要的作用，但由于當(dāng)時技術(shù)的限制，對這一現(xiàn)象的研究未能深入CTCs的首次發(fā)現(xiàn)2005年，Pachm anm將CTCs正式定義為自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。最終定義循環(huán)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展（Circulatin

3、gTumorCells，CTCs）01自強(qiáng)不息 厚德載物Central South University惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床上實(shí)體惡性腫瘤治療失敗或復(fù)發(fā)的主要原因之一該學(xué)說認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展，是處于活躍或活化狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞作為“種子”，當(dāng)遇到適合的器官、組織的基質(zhì)環(huán)境，即“土壤”時，就會在此定居、生長即發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而部分解釋了腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的關(guān)系種子和土壤學(xué)說循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在正是實(shí)體惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的根源02循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC癌細(xì)胞從原位脫離 侵犯血液循環(huán)，在循環(huán)中存活 滲出進(jìn)入遠(yuǎn)端器官 在繼發(fā)部位增殖研究意義：深入研究CTCs有助于對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)一步了解，為抗腫瘤轉(zhuǎn)

4、移的治療提供新的依據(jù)；CTCs的檢測有助于早期轉(zhuǎn)移腫瘤患者的診斷、監(jiān)測術(shù)后患者腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移；有助于評估抗腫瘤藥物的敏感性與患者預(yù)后以及選擇個體化的治療策略；。01循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測難點(diǎn)02循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測難點(diǎn)異質(zhì)性 細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物表達(dá)差異攜帶不同的分子信息轉(zhuǎn)移潛力差異03不同形態(tài)：單細(xì)胞CTC細(xì)胞團(tuán)CTM血小板包裹的CTC不同表型：上皮細(xì)胞表型間質(zhì)細(xì)胞表型（經(jīng)歷EMT)混合表型*將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞等區(qū)分開來。CTCs的鑒定：如何鑒定所獲取的細(xì)胞為CTCs?*從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞CTC的富集：如何獲取CTCs?04循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測自強(qiáng)不息 厚德載物T

5、singhua University of China02循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集原理及方法Principle and method of circulating tumor cell enrichment自強(qiáng)不息 厚德載物05循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集目前對于CTCs的富集主要根據(jù)：物理特性（密度和體積）分子生物學(xué)特性（免疫磁性和浸潤能力）自強(qiáng)不息 厚德載物06基于物理性質(zhì)的分離捕獲方法一、基于腫瘤細(xì)胞大小及機(jī)械性能分離原理：主要依賴于CTCs (1530m) 相對于血細(xì)胞 (811m) 有較大的體積因此, 多種微孔濾膜、尺寸/形變依賴的微流控芯片裝置的方法得到了廣泛研究09基于物理性質(zhì)的分離捕獲方法二、基于

6、細(xì)胞密度離心分離原理：基于血液中各種正常細(xì)胞與CTCs密度的差別，利用其在密度梯度介質(zhì)（如Ficoll-Paque介質(zhì)）中的沉降系數(shù)不同，將細(xì)胞懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力的作用，用分離液將CTCs與其它細(xì)胞層分離梯度分布：血漿成分單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）分離液中性粒細(xì)胞和最下層的紅細(xì)胞自強(qiáng)不息 厚德載物09基于物理性質(zhì)的分離捕獲方法OncoQuick系統(tǒng)使用一種專用的50 mL試管，內(nèi)置多孔屏障，其下為密度梯度分離液，使用時將標(biāo)本置于屏障之上，從而避免在離心之前與分離液混合而污染優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、成本低不足之處：一般要求血量較大，15-30ml；缺乏特異性,

7、靈敏度也較低；CTCs遷移可能至血漿層、紅細(xì)胞層和粒細(xì)胞；操作過程中易導(dǎo)致缺乏相應(yīng)密度的腫瘤細(xì)胞丟失自強(qiáng)不息 厚德載物10基于物理性質(zhì)的分離捕獲方法三、基于細(xì)胞電學(xué)性能分離原理：細(xì)胞可被看作是一種電中性的但是可以被極化的電介質(zhì)粒子。因此, 當(dāng)細(xì)胞處于電場中時, 將產(chǎn)生電偶極矩，電偶極矩的大小和方向主要依賴于細(xì)胞的介電性能。不同的細(xì)胞具有不同的介電性能，這成為分離腫瘤細(xì)胞的依據(jù)在實(shí)際應(yīng)用中, 當(dāng)不同的細(xì)胞處于電場中時, 他們將受到不同的電場力。因此, 腫瘤細(xì)胞可以通過電旋轉(zhuǎn) (Electrorotation) 或者雙向電泳 (Dielectrophoresis, DEP) 的方法得到分離富集優(yōu)點(diǎn)

8、：血液中捕獲腫瘤細(xì)胞的效率達(dá)到70%；無標(biāo)記，細(xì)胞保存良好活性不足之處：細(xì)胞的介電性能會逐漸變化，必須在較短的時間內(nèi)完成；承載介質(zhì)的電導(dǎo)率必須適當(dāng)?shù)目刂圃谝粋€較低的范圍02基于分子生物學(xué)特性的分離捕獲方法免疫磁珠分離：最常見且有效地檢測捕獲脫落腫瘤細(xì)胞的方法陽性富集捕獲腫瘤細(xì)胞負(fù)性篩選去除非腫瘤細(xì)胞（如白細(xì)胞、紅細(xì)胞）腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原標(biāo)志物的表達(dá)抗原-抗體特異性結(jié)合，理論上可以同時實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞捕獲和檢測。自強(qiáng)不息 厚德載物02免疫磁性分離自強(qiáng)不息 厚德載物原理：CTCs具有某些特殊的生物標(biāo)志物，包括上皮細(xì)胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，E

9、pCAM）、細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及腫瘤特異性抗原因此利用腫瘤細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，繼而在外加磁場中與磁珠吸附的細(xì)胞滯留在磁場中或定向移動到指定區(qū)域從而使腫瘤細(xì)胞得以從血液中分離出來自強(qiáng)不息 厚德載物02免疫磁性分離CellsearchTM系統(tǒng)/CTC芯片（CTC-chip）芯片的表層分布了78 000個包被抗EpCAM抗體的微柱點(diǎn)血液樣本流經(jīng)芯片時，抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合粘附在芯片上自強(qiáng)不息 厚德載物02免疫磁性分離優(yōu)點(diǎn)：方便、有效；可獲取較高純度的腫瘤細(xì)胞；富集到具有完整的細(xì)胞形態(tài)不足之處：單克隆抗體昂貴；尚無具有普適性的腫瘤細(xì)胞表面抗原；敏

10、感性一定程度上受到CTCs表面抗原表達(dá)的制約；CTCs經(jīng)歷上皮間質(zhì)化過程(EMT)中，丟失EpCAM這些特異性的分子03循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定原理及方法Principle and method of identification of circulating tumor cells自強(qiáng)不息 厚德載物自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02CTCs的鑒定自強(qiáng)不息 厚德載物如何鑒定所獲取的細(xì)胞為CTCs?免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ICC）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University

11、of China02免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ICC）自強(qiáng)不息 厚德載物原理是以顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和細(xì)胞化學(xué)呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性和定量的技術(shù)。目前選擇的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)抗原包括EpCAM、上皮角質(zhì)蛋白（CKs）、上皮細(xì)胞膜特異性抗原、腫瘤相關(guān)糖蛋白（TAG）或特異性標(biāo)志物（如HER2、抗乳球蛋白等） CTC的免疫熒光染色特性：EpCAM CK DAPI CD45 白細(xì)胞的免疫熒光染色特性：EpCAM CK DAPI CD45優(yōu)點(diǎn)：在于腫瘤細(xì)胞膜未被破壞，可以進(jìn)行細(xì)胞大小和形態(tài)學(xué)分析不足之處：腫瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)的不均一性，在一定程度上降低了檢測的敏感性

12、熒光染料熒光染料自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物Central South University流式細(xì)胞術(shù)（FCM）原理：根據(jù)白細(xì)胞表達(dá)CD45抗原、CK陽性CTCs表達(dá)EpCAM，采用不同熒光素標(biāo)記的抗CD45和抗EpCAM，通過流式細(xì)胞術(shù)分析和分選CK陽性細(xì)胞的CTC（CD45- EpCAM+）優(yōu)點(diǎn)：可在檢測的同時進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析不足之處：需要的血液樣本量大；缺乏規(guī)范的臨床操作方法；腫瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)的不均一性，在一定程度上降低了檢測的敏感性自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of Chin

13、a02自強(qiáng)不息 厚德載物逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）原理：是基于組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后DNA水平的異常，這些mRNA不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞，所以在外周血中檢測到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、可重復(fù)性好、價格低廉不足之處：mRNA不穩(wěn)定；需破壞CTCs，無法計數(shù)及形態(tài)學(xué)觀察；取樣時上皮細(xì)胞污染、腫瘤標(biāo)志物在外周血的非正常表達(dá)可造成假陽性04CellSearch系統(tǒng)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用The CellSearch system and its application 自強(qiáng)不息 厚德載物自強(qiáng)不息 厚德載物02自強(qiáng)不息 厚德載物90年代中期

14、開始摸索捕獲、分析CTC的方法1999-2003 大量臨床實(shí)驗(yàn)建立起CellSearch與CTC的臨床相關(guān)數(shù)據(jù)2004 獲得美國FDA批準(zhǔn)用于臨床2009 Cleveland Clinic十大醫(yī)學(xué)突破第一名2009 Prix Galien USA最佳醫(yī)學(xué)技術(shù)獎2010.1 中國 CTC在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌上的應(yīng)用注冊實(shí)驗(yàn)2011.5 CTC在小細(xì)胞肺癌上的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)研究2012.8 獲得中國CFDA批準(zhǔn)用于臨床1983 磁流體CellSearch CTC 檢測技術(shù)發(fā)展歷程自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物CellSearch檢測技術(shù)的基本

15、原理檢測外周血循環(huán)中的上皮源性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞表型EpCAM+ and Cytokeratins 8, 18+, and/or 19+CD45-完整的細(xì)胞上皮源性細(xì)胞碎片也會被捕獲到，但并不會被計數(shù) 腫瘤細(xì)胞白細(xì)胞抗 EpCAM 磁珠EpCAM 抗原CD45 抗原CK 抗原抗 CD45-APC 染料抗 CK-PE 染料熒光染料EpCAM 上皮細(xì)胞粘附分子 APC 異藻藍(lán)蛋白熒光染料 CK 細(xì)胞角蛋白 PE 藻紅蛋白熒光染料DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料） 自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物知行合一、

16、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch系統(tǒng)概覽第一個標(biāo)準(zhǔn)化，自動化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲計數(shù)平臺自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch自動樣本處理過程自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch自動化結(jié)果分析系統(tǒng)自動將被捕獲的、經(jīng)過染色的細(xì)胞置入MagNest 裝置的樣本盒中由于 M

17、agNest 的磁場作用，捕獲的靶細(xì)胞將移動至樣本盒的分析表面，形成單細(xì)胞層系統(tǒng)自動分析后得到結(jié)果并由操作人員進(jìn)行最終判讀自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch檢測結(jié)果CTCs： DAPI + CK- PE+ CD45- APC-自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch CTC 檢測結(jié)果 Cutoff 值Unfavorable5 CTCs/7.5mlFavorable0-4 CTCs/7.5ml基線 CTC 檢測結(jié)果大于等于5個細(xì)胞病人預(yù)后不好，總生存期和無進(jìn)展生存期較短基線 CTC 檢測結(jié)果小于5個細(xì)胞的病人預(yù)后良好，總生存期和無進(jìn)展生存期較長此 Cutoff 值基于臨床研究實(shí)驗(yàn)得出，并已被 FDA 和 CFDA 批準(zhǔn)用于臨床實(shí)踐 臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)移性癌癥的監(jiān)護(hù)無進(jìn)展生存期總生存期未來: 疾病管理自強(qiáng)不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強(qiáng)不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central