洛伐他汀合成酶調(diào)控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比較

1、洛伐他汀合成酶調(diào)控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比擬【摘要】目的克隆紅曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶調(diào)控基因lvE和kH，并進(jìn)展序列分析和同源性比擬。方法根據(jù)GeneBank土曲霉和紅曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設(shè)計(jì)引物，以土曲霉和紅曲霉基因組DNA為模板PR擴(kuò)增lvE和kH基因并克隆到pD19Tsiple載體。利用DNAAN等軟件以及互聯(lián)網(wǎng)資源對(duì)lvE和kH測(cè)序結(jié)果與其編碼的氨基酸序列進(jìn)展分析比對(duì)。結(jié)果分別擴(kuò)增得到1512bp和1464bp的目的片段lvE和kH。結(jié)論lvE和kH同源性很高，并與GeneBank中相關(guān)序列根本一樣，是洛伐他汀生物合成酶調(diào)控基因，且其表達(dá)產(chǎn)物為GAL4類轉(zhuǎn)錄因

2、子?！娟P(guān)鍵詞】土曲霉紅曲霉洛伐他汀轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因1實(shí)驗(yàn)材料1.1菌株和培養(yǎng)基土曲霉AspergillusterrusTAF93208：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;紅曲霉nasusankaI5031：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;大腸桿菌DH5為本實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌LB培養(yǎng)基和LB/Ap培養(yǎng)基均按實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基的配置方法配置。斜面培養(yǎng)基15g/L：察氏培養(yǎng)基蔗糖30g，NaN33g，K2HP41g，gS47H20.5g，Kl0.5g，F(xiàn)eS47H20.01g，瓊脂15g，純潔水1000L。菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基15g/L：葡萄糖50g，酵母膏10g，番茄醬20g，a31g，pH7.27.5。2實(shí)驗(yàn)方法2

3、.1培養(yǎng)方法用2L無(wú)菌水沖洗孢子，接入固體斜面培養(yǎng)。固體斜面培養(yǎng)7d后，以5L水洗下，稀釋至濃度為107個(gè)/L，取2L參加100L菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速150r/in，28培養(yǎng)4d。2.3PR引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank上公布的土曲霉和紅曲霉洛伐他汀生物合成基因簇登錄號(hào)為AF141925和DQ176595中l(wèi)vE和kH基因設(shè)計(jì)如下引物擴(kuò)該基因。lvEF:ATGGTGAGATAAGGTATAT；lvER:TATGGAGGAATATTGTTGAGG；預(yù)期lvE產(chǎn)物大小為1512bp。kHF:TTAGGAGGAGGTTGTGTTGG；kHR:ATGGTATGAGTAGG；預(yù)期kH產(chǎn)物大小為1464bp

4、。2.4PR反響反響體系：10buffer2L，25l/Lgl21.2L,10l/LdNTPs0.4L,20l/L引物組各0.4L，ddH214.5L，DNA1L，Taq酶0.1L。總體系20L。熱循環(huán)條件：94預(yù)變性5in后，以9430s，5020s，721in40s程序循環(huán)40次，延伸7220in。2.6轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證藍(lán)白斑挑選挑取白斑單克隆菌落PR驗(yàn)證。反響體系：10buffer1L，25l/Lgl21.2L,10l/LdNTPs0.2L,20l/L引物組各0.2L，ddH27.15L，DNA無(wú)菌槍頭蘸取，Taq酶0.1L?？傮w系10L。熱循環(huán)條件：94預(yù)變性5in后，以9430s，5020

5、s，721in40s程序循環(huán)30次，延伸725in。2.7序列分析比對(duì)采用DNAAN軟件將測(cè)序結(jié)果與GeneBank序列進(jìn)展比對(duì)，并通過NBI等網(wǎng)絡(luò)資源分析基因序列及其對(duì)應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)、高級(jí)構(gòu)造和功能。3結(jié)果與分析3.1PR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，說明對(duì)lvE和kH擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物，約為1500bp。為DNAarkerDL2000從上至下分別是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；0為陰性對(duì)照即沒加模圖1PR擴(kuò)增結(jié)果A為lvE，B為kH略Figure1EletrphresisfPRprdutsn1%agarsegelAfrlvEandBfrkH3.2

6、菌落PR驗(yàn)證結(jié)果見圖2，對(duì)lvE和kH擴(kuò)增得到了與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物，約為1500bp。A圖中為DNAarker100bpladder從上至下分別是1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；B圖中為DNAarkerDL2000從上至下分別是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；0為陰性對(duì)照即沒加模板DNA；A圖中1-9是lvE的菌落PR擴(kuò)增結(jié)果；B圖中1-6是kH的菌落PR擴(kuò)增結(jié)果圖2菌落PR結(jié)果A為lvE，B為kH略Figure2Eletrphresisflny

7、PRprdutsn1%agarsegelAfrlvEandBfrkH3.3擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果及分析3.3.1核苷酸及氨基酸分析將重組菌種交英俊生物技術(shù)測(cè)序，lvE的3次測(cè)序結(jié)果與GeneBank中l(wèi)vE通過DNAAN比對(duì)僅在第614位堿基處由置換了T，編碼的氨基酸也僅在第205位氨基酸處由Ala置換了Val；而kH的3次測(cè)序結(jié)果與GeneBank中kH完全一致。由此可見兩者之間的差異可能是個(gè)體多態(tài)性，也證明了洛伐他汀合成酶調(diào)控基因種間保守程度極高。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.3.2亞細(xì)胞定位分析亞細(xì)胞定位研究.n/SubL/說明lv

8、E和kH蛋白未顯示典型的N端信號(hào)肽區(qū)域，SubL分別以84%，94%的準(zhǔn)確度和RI=3，5的可靠性指數(shù)預(yù)測(cè)兩蛋白在核內(nèi)。SignalP分析.bs.dtu.dk/servies/SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示兩蛋白均非分泌蛋白，且存在信號(hào)肽的可能性分別為10.4%和0。Figure3AdvanedstrutureanalysisAfrlvEprteinandBfrkHprtein圖3中兩蛋白均具有Zn2ys6雙核簇合物的鋅指構(gòu)造DNA結(jié)合構(gòu)造域，該保守構(gòu)造域發(fā)現(xiàn)于如GAL4型的轉(zhuǎn)錄因子，曾在釀酒酵母中證實(shí)GAL4為半乳糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)正調(diào)控子。此構(gòu)造域由2個(gè)螺旋環(huán)繞成富集半胱氨酸的鋅指基序參與Zn依

9、賴性的DNA結(jié)合并由無(wú)規(guī)那么卷曲串聯(lián)起來(lái)。該類構(gòu)造域還涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸鹽、麥芽糖和半乳糖的代謝，以及酰胺和氨基丁酸的降解與亮氨酸的生物合成等。4討論洛伐他汀是目前治療高血脂癥的常用藥物之一。國(guó)內(nèi)工業(yè)化消費(fèi)洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者們紛紛以增產(chǎn)洛伐他汀為目的開展多方面的研究。目前從基因工程方面著手改善其產(chǎn)量成為熱點(diǎn)。本文克隆的lvE和kH基因編碼產(chǎn)物是一個(gè)洛伐他汀生物合成的調(diào)控蛋白或轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其深化研究將有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。Kennedy、Park等將lvE基因突變失活導(dǎo)致檢測(cè)不到任何洛伐他汀中間產(chǎn)物，同時(shí)將一個(gè)額外拷貝的lvE轉(zhuǎn)化土曲霉，洛伐他汀產(chǎn)量增加

10、57倍10,16。從上述數(shù)據(jù)可以看出對(duì)lvE和kH基因以及其編碼蛋白的構(gòu)造功能的進(jìn)一步研究將為深化理解洛伐他汀生物合成及其遺傳調(diào)控方面提供參考，且為進(jìn)一步表達(dá)基因、純化相關(guān)蛋白、制備多克隆抗體、研究基因體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄因子與DNA的體外模擬結(jié)合以深化理解該類轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能和作用機(jī)理奠定了實(shí)驗(yàn)基矗本研究利用國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)生物信息學(xué)資源，通過計(jì)算分析兩蛋白物理化學(xué)特性，得知此兩核蛋白和一些轉(zhuǎn)錄因子以及調(diào)控序列編碼產(chǎn)物有共同的GAL4類鋅指構(gòu)造保守序列區(qū)。相似性搜索比對(duì)得知lvE和kH不管基因還是編碼產(chǎn)物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA結(jié)合保守序列。3.3.2亞細(xì)胞定位分析亞細(xì)胞定位研究psrt

11、..n/SubL/說明lvE和kH蛋白未顯示典型的N端信號(hào)肽區(qū)域，SubL分別以84%，94%的準(zhǔn)確度和RI=3，5的可靠性指數(shù)預(yù)測(cè)兩蛋白在核內(nèi)。SignalP分析.bs.dtu.dk/servies/SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示兩蛋白均非分泌蛋白，且存在信號(hào)肽的可能性分別為10.4%和0。Figure3AdvanedstrutureanalysisAfrlvEprteinandBfrkHprtein圖3中兩蛋白均具有Zn2ys6雙核簇合物的鋅指構(gòu)造DNA結(jié)合構(gòu)造域，該保守構(gòu)造域發(fā)現(xiàn)于如GAL4型的轉(zhuǎn)錄因子，曾在釀酒酵母中證實(shí)GAL4為半乳

12、糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)正調(diào)控子。此構(gòu)造域由2個(gè)螺旋環(huán)繞成富集半胱氨酸的鋅指基序參與Zn依賴性的DNA結(jié)合并由無(wú)規(guī)那么卷曲串聯(lián)起來(lái)。該類構(gòu)造域還涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸鹽、麥芽糖和半乳糖的代謝，以及酰胺和氨基丁酸的降解與亮氨酸的生物合成等。4討論洛伐他汀是目前治療高血脂癥的常用藥物之一。國(guó)內(nèi)工業(yè)化消費(fèi)洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者們紛紛以增產(chǎn)洛伐他汀為目的開展多方面的研究。目前從基因工程方面著手改善其產(chǎn)量成為熱點(diǎn)。本文克隆的lvE和kH基因編碼產(chǎn)物是一個(gè)洛伐他汀生物合成的調(diào)控蛋白或轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其深化研究將有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。Kennedy、Park等將lvE基因突變失活導(dǎo)致檢測(cè)不到任何洛伐他汀中間產(chǎn)物，同時(shí)將一個(gè)額外拷貝的lvE轉(zhuǎn)化土曲霉，洛伐他汀產(chǎn)量增加57倍10,16。從上述數(shù)據(jù)可以看出對(duì)lvE和kH基因以及其編碼蛋白的構(gòu)造功能的進(jìn)一步研究將為深化理解洛伐他汀生物合成及其遺傳調(diào)控方面提供參考，且為進(jìn)一步表達(dá)基因、