SNP的理論與應(yīng)用課件

1、定量PCR Taqman探針上個(gè)世紀(jì)90年代原美國Perkin Elmer( PE)公司開發(fā)出了Taqman熒光探針定量技術(shù)，將定量PCR帶入了更廣闊的應(yīng)用空間。Taqman探針法的出現(xiàn)是定量PCR技術(shù)的重要里程碑，之后在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了雜交探針法，以及熒光引物法，是對(duì)探針法的不斷改進(jìn)和簡化。如果希望全面掌握定量PCR技術(shù)的研究人員就不能錯(cuò)過這些定量檢測技術(shù)。要提到熒光探針或者熒光引物，有一個(gè)基礎(chǔ)概念需要首先明確，那就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一對(duì)合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個(gè)能量供體 (donor) 和能量受體

2、 (acceptor) 對(duì), 其中供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當(dāng)它們在空間上相互接近到一定距離(110 nm)時(shí)，激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。能量傳遞的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對(duì)取向、供體與受體之間的距離等有關(guān)。定量PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測都這個(gè)FRET原理相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光中另一個(gè)很重要的概念，即Ct值。C代表循環(huán)。T代表閾值。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)反應(yīng)的前個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是個(gè)循

3、環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍。研究表明，每個(gè)模板的值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)一：水解探針法TaqMan技術(shù)原理：除了一對(duì)特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補(bǔ)的基因特異性探針（通常2030bp），探針上5端和3端分別標(biāo)記了一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)（供體）和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)（受體），在反應(yīng)初始（探針完整）時(shí)系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號(hào)被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時(shí)檢測不到供體熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR過程中Taq DNA聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模版的位

4、點(diǎn)時(shí)，其5-3核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5端的報(bào)告基團(tuán)游離的報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴(kuò)增一條DNA鏈，就對(duì)應(yīng)有一個(gè)游離的熒光分子（報(bào)告基團(tuán)）形成，保證了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測就可以實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR的過程，準(zhǔn)確定量PCR的起始拷貝數(shù)。但是實(shí)際上探針較長使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會(huì)產(chǎn)生不同波長的熒光，都會(huì)使得本底偏高優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏，特異性高：具有模版序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高的定量PCR的專一性；每擴(kuò)增一個(gè)特異

5、產(chǎn)物只釋放一個(gè)分子的熒光染料，儀器檢測的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對(duì)檢測信號(hào)沒有影響，有效提高檢測的專一性。2.有多種不同波長的熒光基團(tuán)對(duì)可供選擇，使得Taqman探針法可以實(shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測多重PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性3.避免了熒光染料對(duì)PCR反應(yīng)的影響缺點(diǎn)：探針設(shè)計(jì)有一定難度，需要驗(yàn)證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高。此外，也有人認(rèn)為，Taqman法利用了Taq酶的外切活性，而由于各家公司出產(chǎn)的Taq酶對(duì)于其外切酶活性并沒有做出嚴(yán)格的活性標(biāo)定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影響，酶活性差異也給定量帶來了不確定性。至少，生物通定量PCR技術(shù)系列前面介紹的Stratagen

6、e 2100萬美元專利之爭的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探針法了！應(yīng)用：Taqman技術(shù)廣泛應(yīng)用在人類傳染病診斷和病原定量上，在動(dòng)物疾病病原體基因的檢測、畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫、生物制品的鑒定以及在疫苗效力測定上等方面都有成功的許多例子。注意：1) 探針長度應(yīng)在15-45bp（最佳20-30bp)左右，以保證結(jié)合的特異性。2) GC堿基含量在40%-60% ，避免單核苷酸序列的重復(fù)。3)避免與引物發(fā)生雜交或重疊。 4)探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度,因此探針的Tm值要比引物的Tm 值至少高出5。另外，探針的濃度，探針與模板

7、序列的同源性，探針與引物的距離都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。另外，在儀器的選擇上也要注意，盡量選擇具有4色或以上的熒光檢測通道的儀器，已保證你的機(jī)器的適用性和試劑選擇的靈活性。畢竟技術(shù)是在快速發(fā)展的。我們前面提到，Taqman水解探針法中，一但報(bào)告基團(tuán)水解離開淬滅基團(tuán)，就一直游離于反應(yīng)體系中可被檢測，所以檢測的是累積熒光，是不可逆的。雜交探針不同，是復(fù)性時(shí)兩條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測信號(hào)，到升溫變性探針遠(yuǎn)離模版就沒有信號(hào)，所以檢測的是實(shí)時(shí)信號(hào)，是可逆的，所以可以進(jìn)行熔解曲線的分析，還可以用于進(jìn)行突變分析，SNP基因分型以及產(chǎn)物鑒別。比如一旦探針位置上出現(xiàn)有點(diǎn)突變，通過熔解曲線就可以很快分

8、析出來，這也是Taqman法無法做到的。另外，由于采用2條模版特異的探針，雜交探針法的專一性無疑更高于其他方法，不受非特異產(chǎn)物的影響。Fret探針法由于需要合成2條探針，探針的末端要封閉以避免反應(yīng)，所以合成的成本會(huì)比較高，也比較麻煩。但實(shí)際上，F(xiàn)ret探針的設(shè)計(jì)其實(shí)比Taqman探針容易，因?yàn)門aqman探針要求一定的長度以保證探針的特異性和結(jié)合模版的能力，但是長度會(huì)導(dǎo)致兩末端的熒光基團(tuán)距離遠(yuǎn)而使得熒光共振能量傳遞的效率降低，淬滅不徹底。Fret探針就不受這個(gè)限制。不管怎么說，多數(shù)人還是習(xí)慣認(rèn)為單探針比合成2條探針要簡單。在水解和雜交探針技術(shù)之間產(chǎn)生另外一種技術(shù)：分子信標(biāo)（分子信標(biāo)產(chǎn)生時(shí)間是1

9、996年）分子信標(biāo)技術(shù)原理：分子信標(biāo)（ Molecular beacon，MB）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30bp（有人認(rèn)為18-20個(gè)bp較好）長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)，莖一般5-7bp長（GC含量較高），相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會(huì)互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序

10、列將與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。應(yīng)用：應(yīng)用于基因定量分析和突變體識(shí)別、疾病基因檢測與診斷、單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究中。優(yōu)點(diǎn)：本底低，特異靈敏缺點(diǎn)：雜交時(shí)探針不能完全與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性較差。探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜延伸技術(shù)：建立在分子信標(biāo)技術(shù)基礎(chǔ)上的探針技術(shù)有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中Sunrise技術(shù)，這一方法的特點(diǎn)是所有的擴(kuò)增產(chǎn)物均能標(biāo)

11、記上熒光分子，因此熒光信號(hào)響應(yīng)快，但無法區(qū)分特異和非特異擴(kuò)增是其致命的不足。第三代、熒光引物Amplifluor技術(shù)原理：激發(fā)的熒光進(jìn)行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。目標(biāo)特異性Amplifluor引物包含一個(gè)5內(nèi)部互補(bǔ)序列，標(biāo)記有熒光發(fā)色團(tuán)（fluorescerin）和一個(gè)能量受體：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)。未結(jié)合的Amplifluor引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團(tuán)和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號(hào)。在第一個(gè)循環(huán)中，Amplifluor引物1與特異CDNA的第一條鏈退火并被Taq酶延伸。在第二個(gè)循環(huán)中 Amplifluor引物1延伸

12、產(chǎn)物作為引物2（反義鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨后的擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)的增強(qiáng)與擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加成比例。LUM技術(shù)原理：LUM(light upon extention) 引物技術(shù)是Invitrogen公司的一項(xiàng)專利，是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。使用類似分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，使引物同時(shí)起到熒光探針的作用。引物對(duì)中的一個(gè)引物3端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對(duì)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號(hào)。使用LUX引物，不需要專門設(shè)計(jì)探

13、針，即省了成本又給實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術(shù)，但非特異性擴(kuò)增或引物二聚體沒有影響，所以其特異性要強(qiáng)于SYBRGREEN?？赐赀@些方法，相信新近接觸定量PCR的人就已經(jīng)覺得眼花繚亂了，其實(shí)雖然以上這些檢測技術(shù)有許多，但是實(shí)際上在商品成熟應(yīng)用上并不是有這么多豐富的選擇，具體的優(yōu)良產(chǎn)品篩選請見：定量PCR經(jīng)典之選Taqman探針科研定量PCR首選雜交探針定量檢測精靈熒光引物中國的PCR達(dá)安單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）：主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類

14、可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個(gè)或4個(gè)等位多態(tài)性，但實(shí)際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉(zhuǎn)換（C T，在其互補(bǔ)鏈上則為G A），也可能是顛換（C A，G T，C

15、 G，A T）。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。Wang等的研究也證明了這一點(diǎn)。轉(zhuǎn)換的幾率之所以高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（coding SNP,cSNP）比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5.但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。從對(duì)生物的遺

16、傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：同義cSNP（synonymous cSNP）：即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP（non-synonymous cSNP）：指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。先形成的SNP在人群中常有更高的頻率，后形成的SNP所占的比率較低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不盡相同，但大約有85%應(yīng)是共通的。SNP自身的特性決定了它更適合于對(duì)復(fù)雜性

17、狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識(shí)別等方面的研究：1、 SNP數(shù)量多，分布廣泛。 據(jù)估計(jì)，人類基因組中每1000個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs.SNP 遍布于整個(gè)人類基因組中，根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三類。2、 SNP適于快速、規(guī)?；Y查。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標(biāo)記，即二等位基因（biallelic

18、）。 由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動(dòng)化技術(shù)篩選或檢測SNPs.3、 SNP等位基因頻率的容易估計(jì)。采用混和樣本估算等位基因的頻率是種高效快速的策略。該策略的原理是：首先選擇參考樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測的混和樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，根據(jù)所得信號(hào)的比例確定混和樣本中各種等位基因的頻率。4、 易于基因分型。SNPs 的二態(tài)性，也有利于對(duì)其進(jìn)行基因分型。對(duì)SNP進(jìn)行基因分型包括三方面的內(nèi)容： （1）鑒別基因型所采用的化學(xué)反應(yīng)，常用的技術(shù)手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應(yīng)、側(cè)翼探針切割反

19、應(yīng)以及基于這些方法的變通技術(shù)； （2）完成這些化學(xué)反應(yīng)所采用的模式，包括液相反應(yīng)、固相支持物上進(jìn)行的反應(yīng)以及二者皆有的反應(yīng)。 （3）化學(xué)反應(yīng)結(jié)束后，需要應(yīng)用生物技術(shù)系統(tǒng)檢測反應(yīng)結(jié)果。SNP檢測技術(shù)snp現(xiàn)有檢測技術(shù)有主要的3大類別1、測序 主要發(fā)現(xiàn)新的snp位點(diǎn)和比較集中的snp位點(diǎn)，如hla區(qū)域，但成本較高，工作量大，不適合大樣本做疾病關(guān)聯(lián)分析。2、taqman探針結(jié)果比較可靠，國外文章也大量應(yīng)用，不過對(duì)于國內(nèi)成本偏高，同類還有snpshot技術(shù)，abi和貝克曼都相應(yīng)試劑盒。成本和成功率都比taqman要低。3、snp芯片國外大規(guī)模篩查疾病關(guān)聯(lián)分析常用，illumina和affy都有不同密度

20、的成熟產(chǎn)品，單位點(diǎn)成本很低，但點(diǎn)較多，樣本多時(shí)也會(huì)很高花費(fèi)，但結(jié)果準(zhǔn)確，適合復(fù)雜疾病，有實(shí)力的項(xiàng)目組一般大型機(jī)器點(diǎn)在384-群基因組可以訂制，但成本會(huì)高；illumina開發(fā)了一臺(tái)小的芯片，極其適合1-384，可以訂制，成本在2-5元/人點(diǎn)，但還沒有很成熟的流程，具體效果和成功率要進(jìn)一步看。剩下的就是傳統(tǒng)方法如酶切，pcr-sscp等，也有雜志接受，但一般需要測序驗(yàn)證。缺點(diǎn)是工作量太大，結(jié)果不準(zhǔn)確，不是所有位點(diǎn)都可以做，但成本很低。突變數(shù)據(jù)庫Human Gene Mutation Database (HGMD) http:/www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html T

21、he Genome Database (GD) SNP數(shù)據(jù)庫Database of Single Nuleotide Polymorphisms (dbSNP) /SNP/ Human Genome Variation Database (HGVbase) http:/hgvbase.cgb.ki.se/The Snp Consortium， LTD.（TSC） / 而STR是 short tandem repeat,短串聯(lián)重復(fù)，一般是CA重復(fù)，重復(fù)次數(shù)很多的。在一個(gè)人的染色體上可以有多種重復(fù)。假設(shè)A個(gè)體，來自父親的染色體重復(fù)了10次，來自母親的那條重復(fù)了11次，B個(gè)體來自父親的染色體重復(fù)了8

22、次，來自母親的那條重復(fù)了14次，那么這樣說這個(gè)STR已經(jīng)有四種等位基因型了，當(dāng)然還有更多的。所以說 ，變異沒有STR那么大。SNP功能研究進(jìn)展 SNP的研究在當(dāng)前仍然可以用入火如荼形容，一方面是各大數(shù)據(jù)庫可以方便檢索到幾乎任何一個(gè)基因的SNP分布及其頻率，另一方面SNP的功能研究有非常大的研究空間和前景，這應(yīng)歸于許多SNP的流行病關(guān)聯(lián)研究重復(fù)性差，因此只有在功能上對(duì)其闡述才能解決根本問題。當(dāng)前SNP功能研究主要有以下幾方面：1、報(bào)告基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：這一技術(shù)主要用于研究啟動(dòng)子SNP對(duì)于mRNA轉(zhuǎn)錄效率，是通過觀察轉(zhuǎn)錄結(jié)局來判斷SNP是否具有功能。2、EMSA技術(shù)：通過在體外合成含SNP位點(diǎn)的寡核苷

23、酸與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合，觀察結(jié)合的強(qiáng)度和效率,但是該技術(shù)由于只人工合成較短長度的寡核苷酸，沒有考慮SNP周圍遺傳背景環(huán)境的影響,因此在重復(fù)性和說服力上不強(qiáng)。3、ChiP技術(shù)：該技術(shù)通過超聲將染色體碎片化,再將碎片化的核酸與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，最后通過PCR技術(shù)觀察判斷結(jié)合的效率和強(qiáng)度，該技術(shù)克服了EMSA的一些缺點(diǎn),當(dāng)前做的文獻(xiàn)較多。Cell上的一篇文章絕對(duì)是SNP功能的經(jīng)典文章，值得一看:Cell, Vol 119, 591-602, 24 November 2004A Single Nucleotide Polymorphism in the MDM2 Promoter Attenuates

24、the p53 Tumor Suppressor Pathway and Accelerates Tumor Formation in Humans,Gareth L. Bond,Wenwei Hu,Elisabeth E. Bond,etal第一個(gè)層次：實(shí)際檢測應(yīng)用這個(gè)層面主要是一些微生物檢測，食品檢測，環(huán)境監(jiān)測以及一些醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用（病源體檢測，基因病診斷，傳染病檢測，微小殘留病變檢測等），在這些方面定量PCR與傳統(tǒng)的方法具有相似的靈敏度，但是耗時(shí)少，需要的勞動(dòng)力也少，而且它們既可以從活著的也可以從死的病原菌中檢測和定量核酸，而傳統(tǒng)的微生物方法只能檢測活的病原菌。這些主要應(yīng)用到的就是定量PC

25、R在核酸濃度上的簡單定量，由于之前要想在分子操作過程中知道核酸的濃度，主要應(yīng)用的方法是瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)，但是這兩種方法前者靠主觀判斷，造成的偏差較大；后者很易受樣品中雜質(zhì)的影響。因此定量PCR 由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)、無污染性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)當(dāng)然成為了首選。第二個(gè)層次：分子生物學(xué)應(yīng)用檢測應(yīng)用和分子生物學(xué)應(yīng)用都是利用了定量PCR對(duì)基因表達(dá)的檢測，只不過前者是在臨床實(shí)際應(yīng)用上，而后者則是側(cè)重于科學(xué)研究。在分子生物學(xué)上定量PCR的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，包括基因轉(zhuǎn)錄檢測（即同一基因在不同組織中的表達(dá)差異），轉(zhuǎn)基因生物檢測，腫瘤耐藥基因表達(dá)等在內(nèi)的高通量基因表達(dá)檢測（雖然Taqman相對(duì)于SYBR G

26、reen熒光染料，沒有那么靈活，但是在陸續(xù)各生物技術(shù)公司推出一些相應(yīng)試劑盒，也保證了Taqman在高通量方面的應(yīng)用）。之前的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是cDNA 芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。定量PCR 技術(shù)的出現(xiàn)無疑為這種檢測提供了極大的方便，利用定量 PCR檢測產(chǎn)物并進(jìn)行熔解曲線分析的方法，已經(jīng)對(duì)cDNA 芯片和差異顯示技術(shù)的結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)，而且得到了更加完整和精確的結(jié)果。第三個(gè)層次：遺傳學(xué)，SNP分析以及深入應(yīng)用點(diǎn)突變分析和等位基因分析：用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的 Taqman 探針分別與野生型和突變基因雜交。探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關(guān)

27、。如果一種染料的熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種則說明它是一個(gè)純合子，如果兩種熒光信號(hào)都增加則表明是一個(gè)雜合子。實(shí)時(shí)定量 PCR 的數(shù)據(jù)被標(biāo)在xy坐標(biāo)軸上來區(qū)分特異的基因型。利用這種方法，能在不到兩個(gè)小時(shí)內(nèi)很快對(duì) 96 個(gè)樣本進(jìn)行基因分型。這一方法最先由Sevall在文章“Rapid allelic discrimination from real-time DNA amplification”中提及。 為了檢測突變體，可以設(shè)計(jì)兩種不同顏色的探針：一個(gè)探針設(shè)計(jì)來檢測野生型，可以標(biāo)記FAM，另一個(gè)標(biāo)記JOE的探針來檢測突變體。通常兩個(gè)探針的差別只有1個(gè)bp，由于兩個(gè)探針相差極小，因此一般推薦使用嚴(yán)格的反應(yīng)

28、條件。 通過分析數(shù)據(jù)，兩個(gè)通道的結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)在一個(gè)屏幕中，沒有標(biāo)記物的曲線是CH1結(jié)果，有循環(huán)數(shù)的是CH2，最多可以有四個(gè)探針(兩個(gè)突變體)可以被分析，在編輯好基因型名稱，將域值調(diào)整到0以上后，結(jié)果就會(huì)在圖下方的表格中顯示出來。DNA甲基化分析： CG 島內(nèi)胞嘧啶的甲基化形成 5-甲基胞嘧啶被認(rèn)為和許多人類疾病特別是癌癥有關(guān)。Laird 等人利用一種被稱作 Methylight 的技術(shù)。 Methylight 是一種基于 Taqman 探針的甲基化特異定量 PCR 技術(shù)。在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區(qū)

29、分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。特異的引物和 Taqman 探針被用來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它實(shí)時(shí) PCR 方法一樣，Methylight無需電泳，因而提高了反應(yīng)的靈敏性和通量。這種方法的靈敏性在食道癌病人血液中癌細(xì)胞異常甲基化的DNA檢測中被證明。 低密度表達(dá)譜分析： 這一方面主要是配合ABI的系列產(chǎn)品：TaqMan Low Density Arrays。這個(gè)芯片是從人，小鼠和大鼠的基因中挑選的4萬個(gè)arrays，可以根據(jù)用戶要求在反應(yīng)板中固化不同基因的檢測探針和引物，同時(shí)檢測1個(gè)標(biāo)本的384個(gè)不同的基因或8個(gè)標(biāo)本的48個(gè)不同的基因，而且這個(gè)試劑盒是pre-loaded，方便使用，同其反應(yīng)體積?。?ul），節(jié)省試劑的優(yōu)點(diǎn)一起構(gòu)成了這個(gè)適用于標(biāo)準(zhǔn)化，中高通量基因表達(dá)研究的試劑。SNP分析：SN