SOD的性質(zhì)與固定化

1、08 級生物工程一班 劉婷婷 0806606114 超氧化物歧化酶與超氧化物歧化酶的固定化 一、超氧化物歧化酶別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡稱：SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代 謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補充 SOD 具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是 1938 年 Marn 等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開始算起，人們對 SOD 的研究己有七十多年的歷史。 1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反 應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。（一）SOD的種類及分布從目前分離取得的

2、SOD 來看，它是一種金屬酶，其金屬部分是酶的輔基組成，對酶的免疫原性也起 很大的作用。根據(jù)酶的金屬輔基的不同，可以大致分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三種類型。（ 1） Cu/Zn-SOD基本上所有的真核細胞的細胞內(nèi)都含有帶有銅和鋅的超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD ）。例如，市場上銷售的從牛紅血球中純化的 Cu-Zn-SOD，PDB 1SXA, EC 1.15.1.1。Cu/Zn SOD是一個二聚 體，分子量為 32,500 。兩個亞基主要通過疏水和靜電相互作用結(jié)合在一起。銅和鋅則與活性位點上 的組氨酸側(cè)鏈形成配位鍵。（ 2）Mn-SOD幾乎所有的線粒體和許多細菌（如大

3、腸桿菌）含有結(jié)合錳的超氧化物歧化酶（Mn SOD ）。例如，人類線粒體中的 Mn-SOD， PDB 1N0J, EC 1.15.1.1 。錳離子與三個組氨酸的側(cè)鏈、一個天冬氨 酸的側(cè)鏈和一個水分子或羥基（取決於錳的氧化態(tài)）配位結(jié)合。（ 3） Fe-SOD大腸桿菌和其他一些細菌還含有結(jié)合鐵的超氧化物歧化酶 （Fe SOD ）：一些細菌只含 Fe SOD， 另一些只含Mn SOD，還有一些則兩種都含有。例如，大腸桿菌中的Fe SOD : PDB 1ISA, EC 1.15.1.1。 Fe SOD 也被發(fā)現(xiàn)存在於植物的色素體中。 Mn SOD 和 Fe SOD 的活性位點具有同樣類型的胺基酸與 金屬

4、離子配位。（二）SOD的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)Cu/Zn-SOD分子量在33 000左右，由兩個亞基組成，每一個亞基各含一個Cu2+和Zn2+離子，紫外 吸收光譜均在250270nm范圍內(nèi)（只有發(fā)光桿菌的Cu/Zn-SOD例外），它們的這一共同特點與一般蛋 白的紫外吸收峰 280nm 均有偏離，其原因是該酶分子中色氨酸和酪氨酸含量少或根本沒有。赤子愛勝蚓 Cu/Zn-SOD 的亞基有 156 個氨基酸殘基，其中甘氨酸含量最大，占氨基酸總量的 21%。鴨血紅細胞 Cu/Zn-SOD的N-端為丙氨酸，分子量為32, 359，由兩個亞基組成。豬紅細胞Cu/Zn-SOD經(jīng)圓二色譜 表明：空間結(jié)構(gòu)呈B-折迭及無規(guī)態(tài)

5、，含有極少量的a-螺旋。Mn-SOD依來源不同有著明顯的差異。原核細胞來源的Mn-SOD分子量為40 000，由兩個亞基組成， 各含一個Mn2+離子。真核細胞線粒體來源的Mn-SOD分子量為80 000，由各含一個Mn2+離子的四個亞 基組成，兩者均呈粉紅色。Fe-SOD僅存在于原核細胞中，制品分子量為38 000，呈黃色，由兩個各含一個Fe2+離子的亞基組 成。棕色固氮菌Av-230中的Fe-SOD，由各含一個Fe2+離子的兩個相同亞基組成，二級結(jié)構(gòu)中，a-螺旋 含量約占 20%左右。總之，不同生物體內(nèi)所含的SOD種類和數(shù)量差異很大，并有很強的組織專一性9。目前已弄清了 七種 SOD 的一級

6、結(jié)構(gòu)。（三）SOD的應(yīng)用SOD作為一種人體內(nèi)最重要的酶之一，它所起的作用是不可小視的。正常生命過程中產(chǎn)生的超氧陰離 子自由基是維持生命所必需的，當(dāng)其濃度過高時，對機體會造成損害。因此超氧化物歧化酶作為生物體內(nèi) 氧自由基的天然特異清除劑，在生物體的生命活動中具有重要意義，有著廣泛的醫(yī)用價值，可作為藥品、 食品及日化產(chǎn)品的添加劑。大量研究表明，SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一。SOD是超氧 化陰離子自由基 O-2 的“克星”，具有抗炎、抗病毒、抗輻射、抗衰老等作用。在病毒性疾病、自身免疫性 疾病、心肌缺血和缺血再灌流綜合癥、老年性白內(nèi)障、心血管疾病、輻射病、癌和癌的放射治療預(yù)防以及 人類

7、長壽等領(lǐng)域的研究中也己有突破性進展。SOD被批準(zhǔn)用于臨床使用，它對一些由于年齡、疾病或傷 害造成的組織硬化以及纖維化顯示出強大的再生修復(fù)能力。 SOD 已被成功的應(yīng)用于放療后的輔助治療、 控制心臟病人的進展、用于治療嚴重的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡等疾病。通過測定SOD酶活性及MDA 水平，可以間接了解體內(nèi)自由基的代謝狀況，了解患者體內(nèi)自由基的活動情況，從而對患者進行相應(yīng)的治 療。在臨床上可用 SOD 治療和預(yù)防下列疾?。杭毙匝装Y和水腫、氧中毒預(yù)防（預(yù)防措施，進入高壓氧艙的 工作人員，可預(yù)先注射SOD）、氧中毒治療、自身免疫性疾?。ㄔ缙谥委煟⒎螝饽[、輻射病及輻射防護、 老年性白內(nèi)障、抗衰老。同時

8、， SOD 具有的抗氧化性及獨特的生理功能使其作為食品添加劑和重要的功能性基料而用于食品工 業(yè)。另外， SOD 既可以作為藥用酶，也可以作為化妝品的添加劑，它最有益的應(yīng)用莫過于抗衰老，國際 生化委員會，F(xiàn)DA稱其為“抗衰因子”，具有抗衰老、防曬、抗炎等功效oSOD可能是真正令我們延長壽命 的有力發(fā)現(xiàn)，科學(xué)工作者將產(chǎn)生人類SOD的基因片段SOD1插入果蠅的運動神經(jīng)細胞，SOD1使果蠅產(chǎn) 生了比一般水平更多的果蠅SOD，更重要的是，它們平均壽命增加了 40%。二、超氧化物歧化酶的固定化 以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，分兩步制備固定化超氧化物歧化酶活化殼聚糖粉的制備：取2. 0 g 殼聚糖粉末，加

9、入25 ml 0. 3%的戊二醛溶液，室溫攪拌3 h后，于4C下放置過夜；次日抽濾，并用50 ml磷酸鹽緩沖液洗滌，得到淡黃色活化的殼聚糖粉末。固定化酶的制備：取0. 5 g 活化的殼聚糖粉末，加入10 ml 超氧化物歧化酶液，室溫下攪拌1. 5 h,于4C下放置過夜；取少量上清液保存在4C待測，將余下的混合物抽濾，并用50 ml磷酸 鹽緩沖液分5次洗滌，即得到固定化SOD酶粉。殼聚糖粉（空白對照）的制備：取0. 5 g 活化的殼聚糖粉末，加入10 ml 小牛血清白蛋白液，室溫下 攪拌1. 5 h,于4C下放置過夜，抽濾，用50 ml磷酸鹽緩沖液分5次洗滌，即得空白對照殼聚糖粉。1、酶活力的測

10、定（1）溶液酶活力的測定：取3支帶刻度的離心管，將溶液酶加入Tris-HCl緩沖液（pH & 02）中預(yù)熱10 min后，加入鄰苯三酚，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min,加入終止劑5%維生素C，室溫放置5 min后測定A325值。按表1加 樣，以1號管溶液為空白，測定各管的a325值。表1溶液酶活力測定實驗抑樣量Tab 1. Samplesfor activity Lesl of SOD before im-HubilizatHm離心管Tris-HClSOD溶叛酶軸45 mmol /1鄰苯三酚00去離子水5礪維生素1：編號緩沖叛fcj410I90020502901010503910100502）固定化酶活力的測定：取3支帶刻度的離心管，將固定化酶及空白對照殼聚糖粉加入Tris-HCl緩沖 液（pH & 02）中預(yù)熱10 min后，加入鄰苯三酚，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min，加入終止劑5%維生素C，在室溫下放 置數(shù)分鐘，3 200 g離心10 min，吸取上清液，測定A325值。按表2加樣，以1號管溶液為空白，測定各 管的A325值。表2固定化酶活力測定實驗加甘量Tah 2. Samples loaded ftw a