試驗(yàn)方法總結(jié)：動(dòng)物模型部分

1、實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)：動(dòng)物模型部分 TOC o 1-5 h z 1、研究腫瘤細(xì)胞增殖 12、研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移 2體外（浸潤模型） 2體內(nèi)（轉(zhuǎn)移模型） 23、研究腫瘤細(xì)胞耐藥 4耐藥細(xì)胞株的建立 4裸鼠移植瘤耐藥模型的建立 5從月中瘤起源分，月中瘤動(dòng)物模型的分類如下:從研究目的來分，可以從增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥三個(gè)角度來分析：1、研究月中瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞準(zhǔn)備：GeneA敲減慢病毒感染細(xì)胞擴(kuò)增至需要的細(xì)胞量。分為：空白對(duì)照 組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。取Balb/c裸鼠，雄性，6周齡，每組10只，適應(yīng)一周后進(jìn)行月中瘤細(xì)胞注射XXX細(xì)胞消化離心后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后取適量的細(xì)胞用PBS懸浮，在Balb/c裸鼠側(cè)腹部皮

2、下接種。每只接種 2 x 106個(gè)細(xì)胞，注射體積為100山。此后，每隔5天測量注射部位月中瘤的體積。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥鈉，小鼠麻醉后置藍(lán)色背景布上拍照（側(cè)臥位，接種部位朝上），小鼠 頸椎脫臼處死，取出月中瘤稱重，將月中瘤置藍(lán)色背景布上拍照，月中瘤一分為二，一 份4%多聚甲醛固定，待后續(xù)病理分析，一份-80C凍存。2、研究月中瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移月中瘤轉(zhuǎn)移的模型包括兩大類：體外（浸潤模型）和體內(nèi)（轉(zhuǎn)移模型）。體外（浸潤模 型）：了解月中瘤細(xì)胞對(duì)周圍相連組織的侵潤性。體內(nèi)模型主要研究月中瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移性即月中瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)端組織形成病灶的能力。體外（浸潤模型）例：浸潤型腦膠質(zhì)瘤動(dòng)

3、物模型的建立方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，將分離和鑒定并轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白 的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞立體定向法行小鼠顱內(nèi)接種，每組10只。小鼠麻醉后頭部正中切口，剝離骨膜后鉆孔（坐標(biāo)是冠狀縫后0.5 cm ,矢狀縫右側(cè)2.5 cm）。取2 山膠質(zhì)瘤干細(xì)胞以1 x 104 cells /只小鼠的劑量，經(jīng)微量注射器緩慢注射入鼠腦紋狀體內(nèi)（深度是2.53 mm）。在確定的時(shí)間點(diǎn)處死一部分動(dòng)物進(jìn)行熒光（立 體熒光顯微鏡下）病理證實(shí)和比較，同時(shí)檢查腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體內(nèi)生長特征以 及干細(xì)胞標(biāo)志物等。體內(nèi)（轉(zhuǎn)移模型） 例：肩胛部皮下接種的方法建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型， 目的：觀察壯骨鎮(zhèn)痛膠 囊對(duì)裸鼠乳腺

4、癌移植瘤模型 骨轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)整聯(lián)蛋白a V03 （ITG-aV03）及骨唾 液酸蛋白（BSP）表達(dá)的影響。方法：取處于對(duì)數(shù)生長期的 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 ,用0.25%胰蛋白酶消化 制成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2Xl07j/mL, 按0.2 mL/只接種于裸鼠右前肢肩胛上區(qū)，接種部位可以見一皮丘，質(zhì)軟， 2天 后，皮丘基本吸收，10天后接種部位可觸及米粒大結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，即乳腺癌移植 瘤組織。檢測壯骨鎮(zhèn)痛膠囊 對(duì)移植瘤組織中IGT-av陽和BSP表達(dá)的影響。例：原位移植建立人 腎透明細(xì)胞腺癌 裸鼠轉(zhuǎn)移模型，觀察月中瘤病理學(xué)特征。方法：收集體外培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長期

5、 786-0細(xì)胞（人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞），進(jìn)行 裸鼠皮下注射，待皮下移植瘤長至直徑為 1.5cm左右時(shí)取出，以相同方法進(jìn)行 鼠間傳代（每代2只），34代后取出移植瘤，剪成1mm 3大小進(jìn)行腎包膜下 原位接種，獲人月中瘤裸鼠轉(zhuǎn)移模型，即外科原位移植（ Surgical Orthotopic Implantation , SOI）模型，裸鼠垂死時(shí)脫頸處死，取出肺臟轉(zhuǎn)移灶體外培養(yǎng)， 胰酶消化傳代45次后即獲得較純的月中瘤細(xì)胞，命名為 786-0-LM1。同時(shí)采用 786-0細(xì)胞懸液進(jìn)行腎包膜下原位注射，建立細(xì)胞原位注射模型。腫癌的常見轉(zhuǎn)移部位膀胱癌淋巴結(jié).腎、泌尿生si系統(tǒng)、腹膜腦腫瘤腦膜乳腺俎骨.

6、肺.肝.淋巴結(jié).腦.骨髓皂頸癟骨.肺.肝.淋巴結(jié).腎、泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)腸癌肺.肝,淋巴結(jié).腎*泌尿生殖系統(tǒng)食管瘍淋巴結(jié).骨 肺.肝.腎上膘頭頸部腫痛肺.皮膚、淋巴結(jié)肝痛骨.肺、淋巴結(jié)腎癌骨.肺.肝.淋巴結(jié).隨白血病/淋巴痛 骨、骨髓，皮膚.肺，淋巴結(jié).腦肺眼胃.骨髓.肝.淋巴結(jié).腦.腎.泌尿生殖系統(tǒng)黑色素瘤骨.肺.肝,淋巴結(jié)、骨髓.皮膚、腦卵巢癌肺.肝.淋巴結(jié).腸、旗膜胰腺癌肺,肝.腸、淋巴結(jié)前列腺癌骨.骨髓、肺、肝.淋巴結(jié)肉痛肺.肝.淋巴結(jié)胃癌骨.肺.肝.淋巴結(jié)塞丸癟骨.肺.肝.淋巴結(jié)甲狀腺癌骨.肺.淋巴結(jié)子宮癌骨3、研究月中瘤細(xì)胞耐藥耐藥細(xì)胞株的建立本實(shí)驗(yàn)以紫杉醇為誘導(dǎo)藥，以人食管鱗癌細(xì)胞系

7、EC109為誘導(dǎo)對(duì)象，采用高劑量間歇誘導(dǎo)結(jié)合時(shí)間遞增的方法建立耐藥細(xì)胞株。終濃度為0.625 回/ml的紫 杉醇（此濃度是紫杉醇對(duì)EC109細(xì)胞IC50的12.5倍）作用于對(duì)數(shù)生長期的EC109兩個(gè)小時(shí)，之后棄含藥培養(yǎng)基，用 4 CPBS洗三次，0.25%胰蛋白酶消化處理，800r/min離心4min收集細(xì)胞，加培養(yǎng)基重懸，重新接種于培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；24小時(shí)后可見大量細(xì)胞死亡，不斷去除凋亡細(xì)胞，擴(kuò)增活細(xì)胞，至生 長狀態(tài)良好，達(dá)到70%80%飽和時(shí)，傳代培養(yǎng)3代；重復(fù)上述操作兩次，即EC109細(xì)胞在此階段共被藥物作用 3次，得到細(xì)胞 EC109/Taxol。MTT實(shí)驗(yàn) 測定親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞對(duì)多種細(xì)胞毒類化合物的敏感性。裸鼠移植瘤耐藥模型的建立無菌條件下收集親本株 EC109和 耐藥株EC109/Taxol細(xì)胞，用無菌生