DNA芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用

1、DNA芯片技術(shù)原理與應(yīng)用 第1頁 主要內(nèi)容 DNA芯片技術(shù)概況DNA芯片技術(shù)應(yīng)用概況存在一些問題及展望第2頁1 DNA芯片技術(shù)一些概況 DNA芯片也稱DNA微陣列,是生物芯片一個。基因芯片原理最初是由核酸分子雜交衍生而來,即應(yīng)用已知序列核酸探針對未知序列核酸序列進行雜交檢測1.1 DNA芯片技術(shù)概念和基本原理第3頁 DNA芯片技術(shù)，實際上就是一個大規(guī)模集成固相雜交，是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備DNA探針以顯微打印方式有序地固化于支持物表面，然后與標識樣品雜交。經(jīng)過計算機對雜交信號檢測分析，得出樣品遺傳信息(基因序列及表示信息)。因為

2、常計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。第4頁 基因芯片制備及檢測流程是利用原位合成法或?qū)⒁押铣珊靡幌盗泄押塑账嵋灶A(yù)先設(shè)定排列方式固定在固相支持介質(zhì)表面,形成高密度寡核苷酸陣列,樣品與探針雜交后,由特殊裝置檢出信號,并由計算機進行分析得到結(jié)果。第5頁原理以下列圖：第6頁基因芯片電子芯片集成電子線路集成份子線路第7頁基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray第8頁近7(.9前)年來公開發(fā)表與基因芯片相關(guān)學(xué)術(shù)論文第9頁1.2 DNA芯片分類 據(jù)不一樣分類標準,DNA芯片分類以下: (1)依據(jù)固相支持物不一樣,D

3、NA芯片分為無機(玻璃、硅片、 陶瓷等)和有機(聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)芯片。(2)依據(jù)芯片上所用探針不一樣分為寡核苷酸芯片和cDNA 芯片。(3)依據(jù)芯片點樣方式不一樣,可分為原位合成芯片、微矩陣芯片(分噴點和針點)和電定位芯片3類。(4)依據(jù)用途不一樣分類為基因表示芯片和基因測序芯片。第10頁1.3 DNA芯片優(yōu)點 作為新一代基因診療技術(shù)，DNA芯片突出特點在于快速、高效、敏感、經(jīng)濟，平行化、自動化等，與傳統(tǒng)基因診療技術(shù)相比，DNA芯片技術(shù)含有顯著優(yōu)勢： （1）快速準確 （2） 檢測效率高 （3）基因診療成本降低。 （4）自動化程度高 （5） 防止了交叉感染 （6）多功效 （7）

4、高度平行性第11頁DNA芯片技術(shù)步驟DNA芯片制備光蝕刻合成法 電壓印刷法 點樣法 樣品制備 雜交 雜交圖譜檢測和讀出 為了提升結(jié)果準確性，來自血液或組織中DNA/mRNA樣本須先行擴增，然后再被熒光素或同位素標識成為探針。雜交條件選擇要依據(jù)芯片上核酸片段長短及其本身用途來定。激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng) CCD攝像原理 檢測系統(tǒng)質(zhì)譜法 1.4 DNA芯片制備過程第12頁1.4.1 DNA芯片制備 原位合成法(in situ synthesis)借鑒半導(dǎo)體攝影平版印刷技術(shù),在固相載體上原位合成寡核苷酸探針序列。主要有光蝕刻法及壓電印刷法。 光蝕刻法基本過程為:光有選擇地照射到有光掩蔽劑保護玻璃片上,

5、以去掉玻璃片上光敏集團,激活DNA合成過程,在去掉光敏集團特定部位偶聯(lián)一個光保護堿基,再將第二個光掩蔽劑置于這個受光保護堿基上,如此不停地去保護和偶聯(lián),就能夠得到寡核苷酸片斷,許多這么不一樣序列片段就組成了DNA方陣。第13頁 原位合成(In Situ Synthesis)Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is di

6、rected through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.光定向合成寡核苷酸第14頁 壓電印刷法基本原理類似于當前采

7、取噴墨打印機:打印頭在方陣上移動,在方陣每點上電流使噴頭放大,并將裝有機某種堿基試劑滴在晶片表面,然后固定,在洗脫和去保護后另一輪寡核苷酸延伸就能夠繼續(xù)進行。壓片印刷法因為不需要與載體表面直接接觸,故有很高效率,但制造工藝還不太成熟。第15頁噴墨打印技術(shù)第16頁離片合成法(off-chip synthesis)首先利用各種方法制備出寡核苷酸探針，再由含有多個微細加樣孔陣列復(fù)制器(arraying and replicating device,ARD)及由電腦控制機器將探針按一定次序固定在固相載體表面，再由紫外交線交聯(lián)固定后得到DNA方陣。該方法優(yōu)點是芯片制造速度快,成本低,而且芯片之間制造誤差

8、小。其缺點是與原位合成法相比,組成方陣DNA片段需要先合成、純化，以及在制造DNA芯片前必須將如此大量含有微小差異片段分別保留,而且需要特制自動點樣裝置。第17頁 點樣法 即預(yù)先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分離得到cDNA，再經(jīng)過點樣機直接將其點到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸合成主要是經(jīng)過多孔玻璃合成法。肽核苷酸即使在制備上比較復(fù)雜，不過它與DNA探針相比，因為PNA（肽核酸）與DNA結(jié)合復(fù)合物愈加穩(wěn)定和特異，因而愈加有利于單堿基錯配基因檢測。 來自某一細胞cDNA必須進行預(yù)處理，純化，擴增以及分類，然后再利用機械手把它們準確地固定在基板對應(yīng)位置上，為了確保cDNA芯片檢測準確性，在制備cDNA芯片

9、以前必須提升低表示基因cDNA豐度，降低高表示基因cDNA豐度。第18頁1.4.2 樣品制備 樣品制備包含：樣品分離純化，擴增，標識 分離純化：樣品起源于活細胞，使用一定方法分離并純化DNA或RNA（尤其是mRNA）。只有到達一定純度樣品，才能確保后續(xù)操作正確。 第19頁樣品擴增：擴增目標在于取得足夠樣品量?，F(xiàn)已發(fā)展出固相PCR系統(tǒng)。樣品標識：主要采取熒光標識法，也可用生物素，或放射性核標識。標識方式采取PCR或RT-PCR。慣用熒光色素為Cy3、Cy5。用Cy3、Cy5標識dNTP，經(jīng)PCR后，產(chǎn)物即可被標識。待測樣品和對照可采取雙色熒光標識。第20頁1.4.3 分子雜交芯片雜交：將已知序列

10、DNA探針顯微固化于支持物表面，將已標識好樣品與之進行雜交，雜交過程普通在30分鐘完成。電子基因芯片：雜交速度更加快。采取肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探針可消除DNA二級結(jié)構(gòu)影響。第21頁1.4.4 遺傳信息檢測原理：待測樣品與支持物上探針列陣雜交后，熒光標識樣品結(jié)合在芯片特定位置，未結(jié)合探針被除去；樣品與探針嚴格配正確雜交分子，熱力學(xué)穩(wěn)定性高，產(chǎn)生熒光信號強，不完全配正確，熒光信號弱；不能雜交不產(chǎn)生熒光信號。分析：采取激光掃描或激光共聚焦顯微鏡采集雜交信號（位置、強度、顏色），并與對照比較，經(jīng)相關(guān)軟件進行圖像和數(shù)據(jù)處理。即可得也待測樣品信息。經(jīng)以上取得數(shù)據(jù)十分龐

11、大，還需進行分析，比較，歸納，才能得出明晰結(jié)論。第22頁 第23頁DNA芯片應(yīng)用領(lǐng)域科學(xué)研究臨床疾病診療環(huán)境檢測藥品研究開發(fā)法醫(yī)學(xué)判定動植物檢疫食品檢測軍事應(yīng)用健康管理運動醫(yī)學(xué)第24頁DNA芯片應(yīng)用概況2.1 基因表示分析與檢測 將不一樣條件下某生物體中轉(zhuǎn)錄出mRNA標識后與代表它全部基因而制成DNA芯片雜交,經(jīng)過分析雜交位點及其信號強弱,就可得出不一樣條件下各基因表示情況,還可判定出一些未知功效基因,發(fā)覺新基因,這一應(yīng)用當前已成為DNA芯片研究中一個重點和熱點。 DNA芯片含有高度敏感性和特異性，可自動、快速地同時檢測成千上萬個基因表示，基因表示分析研究有利于揭示不一樣層次上多基因協(xié)同作用生

12、命過程。第25頁應(yīng)用cDNA表示譜芯片對大鼠心臟生長發(fā)育及損傷過程中基因表示改變進行了研究。心臟從胚胎到成年發(fā)育過程中基因表示發(fā)生了顯著改變，在1075點芯片上，以成年心臟作為對照，胚胎期差異表示基因多于初生期差異表示基因，而在胚胎期中第13天差異表示最顯著，然而當出現(xiàn)心肌肥厚和心力衰竭時，有些在心臟發(fā)育期才表示基因重新被表示，這說明壓力負荷誘發(fā)基因表現(xiàn)型與心臟生長發(fā)育基因表現(xiàn)型有某種關(guān)聯(lián)。 第26頁2.2 基因突變及多態(tài)性檢測 將DNA芯片技術(shù)用于檢測分子突變，能準確地確定突變位點和突變類型，檢測多個基因乃至整個基因組突變。Hacia等采取含有96000個寡核苷酸探針芯片研究遺傳性乳腺癌和卵

13、巢癌易感基因BRCA1外顯子11位點可能發(fā)生突變，結(jié)果在15例患者樣品中檢測到14例患者存在不一樣突變（包含點突變、插入、缺失等突變），而在20個對照樣品中均沒出現(xiàn)假陽性，同時還檢測出了8個單核苷酸多態(tài)（SNP）。在多態(tài)性研究方面，Kozal等應(yīng)用基因芯片研究未曾接觸蛋白質(zhì)酶抑制劑HIV患者中HIVlclade蛋白質(zhì)酶多態(tài)，總共分析了114例樣本，發(fā)覺蛋白質(zhì)酶基因存在很大程度多態(tài)性，所表示結(jié)果與sanger法檢測結(jié)果一致性達98%。 第27頁2.3 測序經(jīng)過與一組已知序列寡核苷酸探針雜交，利用雜交譜來重建待測DNA序列，該技術(shù)為大規(guī)模測序提供了方便、快捷、準確伎倆，同時也有利于了解基因表示模式

14、、基因突變和多態(tài)性，發(fā)覺新基因以及克隆特異性基因。利用固定探針與生物樣品靶序列進行分子雜交,得到特定雜交圖譜,進而分析出待測樣品序列,稱為雜交測序(Sequencing by hybridization, SBH)。Chee等人用含135000個核苷酸探針（每個探針長度為25個核苷）陣列測定了全長為16.6kb人線粒體基因序列，準確率達99%。第28頁第29頁采取樣本核酸提取樣品標識反轉(zhuǎn)錄擴增放大雜交反應(yīng)洗脫讀取信息，診療結(jié)果第30頁2.4 在臨床上應(yīng)用2.4.1疾病診療人類疾病與遺傳基因親密相關(guān)，經(jīng)過分析比較正常人和病人基因表示圖譜差異能夠得出病變基因信息，大規(guī)模篩查出由基因突變引發(fā)疾病，當

15、前DNA芯片已被廣泛應(yīng)用于癌癥相關(guān)基因突變快速檢測。Moch等用532個腎癌組織標本構(gòu)建了5184點cDNA表示譜芯片，經(jīng)過與正常腎組織進行比較，在癌細胞中篩選出89條基因差異表示，其中有一條編碼波形蛋白基因，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對這條波形蛋白基因表示進行研究，發(fā)覺它與患者預(yù)后呈顯著負相關(guān)，而與腫瘤分級和分期無關(guān)。第31頁 基因芯片藥品篩選是指經(jīng)過用藥前后表示譜改變找出靶基因及受靶基因調(diào)控基因是否恢復(fù)到正常狀態(tài),而且用基因芯片作大規(guī)模藥品篩選研究能夠省略大量動物試驗,縮短藥品篩選所用時間。當代藥品篩選中,對藥品篩選影響更直接是藥品作用新靶發(fā)覺,而這些新靶普通是由新發(fā)覺基因編碼,因而當前大部分研

16、究人員以基因為基礎(chǔ)藥品研究過程是:基因組-新靶點篩選。先導(dǎo)物-藥品,即基因-受體-藥品。2.4.2 藥品篩選第32頁 近年來,依據(jù)組合化學(xué)理論設(shè)計各種化合物文庫開始用于藥品篩選,其中可放大生物文庫建立和應(yīng)用,以及高通量自動化藥品篩選技術(shù)出現(xiàn),意味著大批量化合物能夠在很短時間內(nèi)快速地進行篩選。應(yīng)用芯片技術(shù)對生物文庫進行藥品篩選,其基本原理是在芯片或合成珠等固相表面上進行原位文庫合成和篩選。第33頁 2.4.3 DNA芯片在乙型肝炎病毒基因突變分析中應(yīng)用 乙型肝炎病毒(HBV)為一部分雙鏈DNA病毒，主要引發(fā)急、慢性肝炎,部分重復(fù)感染患者可發(fā)展成肝炎、肝硬化或肝癌。HBV在復(fù)制過程中因為有逆轉(zhuǎn)錄過

17、程參加，因而較其它DNA病毒更輕易發(fā)生突變，當前研究較多且臨床意義較為明確突變是HBV前C區(qū)1 896位、基本關(guān)鍵開啟子(BCP)區(qū)1 762、1 764位以及聚合酶基因P區(qū)528位、552位突變。第34頁 王永忠等應(yīng)用膜顯色DNA芯片法同時檢測這些位點突變,試驗結(jié)果顯示，HBsAg+、HBeAg+、HBeAb-患者病毒沒有變異；HBsAg+、HBeAg-、HBeAb+患者HBV前C區(qū)1 896位、BCP區(qū)1 762、1 764位變異較多；HBsAg+、HBeAg+、HBeAb+患者HBV前C區(qū)1 896位變異低于“小三陽”患者，而BCP區(qū)1 762、1 764全部發(fā)生了變異。接收拉米夫定治療

18、48周后HBVDNA陽性患者中，HBV P區(qū)基因變異較多,試驗結(jié)果表明,膜顯色DNA芯片法用于乙型肝炎病毒基因突變分析，簡便、快速、特異性好。第35頁2.4.4 DNA芯片用于腫瘤基因表示研究 DNA芯片為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中基因開關(guān)及表示程度提供了強有力工具，利用它可隨時獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因表示模式,所以基因芯片技術(shù)被大量用于腫瘤基因表示研究。Derisi等應(yīng)用DNA芯片技術(shù)檢測了腫瘤抑制相關(guān)基因表示,把人6號染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)入人黑色素瘤細胞株,該瘤致病性被抑制。第36頁 2.4.5 DNA芯片在人白細胞抗原A19組基因快速分型中應(yīng)用研究 血清學(xué)分型是人白細胞抗原A位點(HLA-A

19、)經(jīng)典分型方法，而此方法交叉反應(yīng)，尤其是HLA-A19分裂子之間較強交叉反應(yīng),及淋巴細胞膜抗原弱表示，經(jīng)常產(chǎn)生分型技術(shù)難點和判斷誤差，并直接影響器官移植效果。李成濤等利用DNA芯片技術(shù),依據(jù)HLA-A位點不一樣基因亞型獨特序列設(shè)計探針,制成份型芯片；待檢測樣品經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)標識上熒光之后,與芯片進行雜交,依據(jù)雜交產(chǎn)生熒光信號值，分析確定樣品A位點基因亞型。第37頁 2.4.6 DNA芯片用于細菌分型利用基因芯片技術(shù)對致病菌基因組DNA、rRNA進行遺傳分析,從而能夠計算出細菌種屬間遺傳距離或者分析和判斷菌體毒性等。有研究者建立了一張空腸彎曲菌基因組芯片,與不一樣致病菌基因組DNA雜交

20、,結(jié)果顯示被檢測11種致病菌基因組DNA中21%基因沒有雜交信號,說明這些基因在被檢細菌基因組中存在高度差異性。第38頁2.4.7 DNA芯片在男科學(xué)研究中應(yīng)用 睪丸是合成雄激素和產(chǎn)生精子主要器官,不過睪丸組織不一樣發(fā)育階段及其內(nèi)在生精過程所表示基因研究當前還知之甚少。Sha等利用人睪丸cDNA文庫構(gòu)建了含有9 216個克隆人睪丸cDNA芯片,用于判他人胚胎睪丸和成人睪丸組織差異表示基因譜,得到731個在人胚胎睪丸和成人睪丸中差異表示基因,其中已知基因是54個,在這54個基因中18. 52%已被以前研究證實為精子發(fā)生所特有。這個結(jié)果也證實了用睪丸芯片判別睪丸功效相關(guān)基因可行性。第39頁 2.4

21、.8 DNA芯片在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用 法醫(yī)檢驗中能夠用DNA芯片分析SNPs位點,從而判定親子關(guān)系和個人識別。美國Nanogen企業(yè)研制出SNPs分析主動式電磁DNA芯片,能夠在幾分鐘內(nèi)完成檢測,能適應(yīng)法醫(yī)檢驗要求。Gabriel等用27條探針DNA芯片,對105個樣本線粒體HV/HV區(qū)域SNPs進行了分析,而且用它分析了實際案例中毛發(fā)和骨骼等檢材,證實該方法用于法醫(yī)檢案是可行。 第40頁2.5 新藥研究與開發(fā)傳統(tǒng)新藥研究是以體外培養(yǎng)人體細胞及動物模型為對象，但二者均不一樣于正常人體體內(nèi)條件，利用DNA芯片技術(shù)能夠了解組織細胞在正常狀態(tài)與病理情況下基因表示改變。DNA芯片對藥品篩選即是經(jīng)過用藥前后組織細胞基因表示改變，找出靶基因及受靶基因