酵母雙雜交(自激活)

1、酵母雙雜交(自激活)第1頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三真核生物的轉(zhuǎn)錄因子是由兩個(gè)可以分開(kāi)的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成的。一、原理酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNA binding domain,BD)，C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation domain,AD)。第2頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三 GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)結(jié)合。 AD則能激活

2、UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過(guò)某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活功能。第3頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三第4頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三第5頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三His, -gal第6頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三 一般情況下，單獨(dú)的 BD 可以與 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合，但不能引起轉(zhuǎn)錄。然而，將一段具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建到BD載體上，若其表達(dá)產(chǎn)生的 BD 單獨(dú)與 UAS 結(jié)合也可

3、以引起下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，那么就稱(chēng)之為酵母雙雜中的自激活現(xiàn)象。反過(guò)來(lái)，可以利用這種自激活現(xiàn)象來(lái)驗(yàn)證某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。第7頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三His, -gal自激活原理Transcription factorsGAL4BD第8頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三YPDA液體 500ml固體 100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g瓊脂2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培養(yǎng)基0.2g ade定容至 100ml 0.2%的ade母液pH 6.5 滅菌 121 15min第9頁(yè)，共15頁(yè)，2022年

4、，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三正對(duì)照：pGAL4負(fù)對(duì)照： pBD-GAL4第10頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三將-70下凍存的酵母菌在YPAD平板上劃線，倒置于30培養(yǎng)2-3天。挑取2-4個(gè)大菌落（直徑2-3mm）于1.5ml YPAD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩5min，打散菌落，接種于50ml YPAD液體培養(yǎng)基中（250ml三角瓶），230-250轉(zhuǎn)/min，30培養(yǎng)18-24hr。取菌液測(cè)定其OD600值，需達(dá)到1.5。若不到，再培養(yǎng)12hr，若還不到，換單克隆重?fù)u。取50ml菌液于300mlYPAD培養(yǎng)基中（1-2L大三角瓶），30，230rpm，搖培3hr

5、，至 OD600值為0.40.6。4000rpm 5min 于常溫收集菌體，重復(fù)一次。室溫下1000g離心5min，去上清，加入50ml 超純水清洗懸浮3次。1000g離心5min，棄上清，用新配的1.5ml 1TE/LiAc重懸細(xì)胞，置冰上，即成為酵母感受態(tài)細(xì)胞。（只能現(xiàn)做現(xiàn)用，不能貯存，室溫只能放置1-2hr）。酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞制備：第11頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三 酵母轉(zhuǎn)化鮭魚(yú)精 DNA（20g/l）沸水中煮20min，冰上冷卻10min。加入100l酵母感受態(tài)細(xì)胞、12l構(gòu)建質(zhì)粒（約200ng）、100g鮭魚(yú)精、600l TE-LiAc-PEG，變速渦

6、旋10s1min至混勻。30，200rpm/min，恒溫?fù)u床振蕩30min。加入70l DMSO，溫和顛倒混勻。42水浴熱休克15min，后冰浴10min。常溫下，3000rpm離心10s；棄上清（去干凈），用0.5ml 1TE重懸細(xì)胞。（ 1TE室溫只能放置12hr）將轉(zhuǎn)化后的酵母培養(yǎng)于SD/-Trp培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)約3-5天，直至出現(xiàn)菌落。第12頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三陽(yáng)性克隆的篩選： 將在SD/-Trp培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的酵母菌落轉(zhuǎn)移到SD/-His培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。30培養(yǎng)2天，檢查生長(zhǎng)情況。 對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)較好的單克隆進(jìn)行-半乳糖苷酶活性分析。第13頁(yè)，共15頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)56分，星期三-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆濾紙顯色分析）取2ml的Z緩沖液/X- gal溶液潤(rùn)透2張濾紙；小心取一張濾紙覆蓋于生長(zhǎng)有轉(zhuǎn)化子的平皿上，用涂布棒小心趕出氣泡，使濾紙盡可能與酵母菌接觸（1min）；用一根針在濾紙上刺個(gè)小孔以標(biāo)記菌落位置，用鑷子輕輕取出濾紙，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夾出濾紙，室溫解凍；重復(fù)3次；沾有菌的面朝上，緊貼于預(yù)先用Z緩沖液/X-gal溶液潤(rùn)透過(guò)的那張濾紙上，同時(shí)吸掉多余的Z緩沖液/X-g