生物化學和分子生物學人衛(wèi)DNA合成市公開課金獎市賽課一等獎課件

1、 作者 : 齊煒煒 高國全單位 : 中山大學中山醫(yī)學院第十二章 DNA合成第1頁第一節(jié) DNA復制基本規(guī)律第二節(jié) DNA復制酶學和拓撲學第三節(jié) 原核生物DNA復制過程第四節(jié) 真核生物DNA復制過程第五節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄第2頁重點難點熟悉了解掌握掌握DNA復制體系組成、半保留復制特點及其意義；掌握DNA復制基本規(guī)律， DNA聚合酶類型及功效特點DNA復制過程，原核DNA復制與真核DNA復制主要區(qū)分；真核生物DNA端粒及端粒酶非染色體DNA復制其它形式；了解逆轉(zhuǎn)錄發(fā)覺發(fā)展了中心法則第3頁DNA復制基本規(guī)律The basic law of DNA replication第一節(jié)第4頁DNA復制主要特征: 半保

2、留復制(semi-conservative replication)雙向復制(bidirectional replication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuous replication)第5頁在復制時，親代雙鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板，依據(jù)堿基配對規(guī)律，合成序列互補子鏈DNA雙鏈一、DNA以半保留方式進行復制半保留復制概念: 第6頁子鏈繼承母鏈遺傳信息幾個可能方式: 全保留式 半保留式 混合式 第7頁密度梯度試驗:含15N-DNA細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第二代第8頁依據(jù)半保留復制方式，子代DNA中保留了親代全部遺傳信息，親代與子代DNA之

3、間堿基序列高度一致遺傳保守性，是物種穩(wěn)定性分子基礎，但不是絕正確半保留復制意義: 第9頁TCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGAGGTACTGTCCATGACAGGTACTGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGG+母鏈DNA復制過程中形成復制叉子代DNA第10頁二、DNA復制從起始點雙向進行原核生物基因組是環(huán)狀DNA，只有一個復制起點（origin）。復制從起點開始，向兩個方向進行解鏈，進行是單點起始雙向復制復制中放射自顯影圖象第11頁A. 環(huán)狀雙

4、鏈DNA及復制起始點B. 復制中兩個復制叉C. 復制靠近終止點(termination, ter)oriterA B C第12頁真核生物每個染色體又有多個起點，呈多起點雙向復制特征。每個起點產(chǎn)生兩個移動方向相反復制叉，復制完成時，復制叉相遇并匯合連接。從一個DNA復制起點起始DNA復制區(qū)域稱為復制子（replicon）。復制子是含有一個復制起點獨立完成復制功效單位53oriorioriori53第13頁53oriorioriori535533553復制3第14頁三、DNA復制以半不連續(xù)方式進行3535解鏈方向35335領(lǐng)頭鏈(leading strand)后隨鏈(lagging strand)

5、第15頁沿著解鏈方向生成子鏈DNA合成是連續(xù)進行，這股鏈稱為前導鏈（leading strand）另一股鏈因為復制方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)延長，只能伴隨模板鏈解開，逐段地從53生成引物并復制子鏈。模板被打開一段，起始合成一段子鏈；再打開一段，再起始合成另一段子鏈，這一不連續(xù)復制鏈稱為后隨鏈（lagging strand）沿著后隨鏈模板鏈合成新DNA片段被命名為岡崎片段（Okazaki fragment）第16頁四、DNA復制含有高保真性“半保留復制”確保親代和子代DNA分子之間信息傳遞絕對保真性高保真度DNA聚合酶利用嚴格堿基配對標準是確保復制保真性機制之一；體內(nèi)復制叉復雜結(jié)構(gòu)提升了復制準

6、確性；DNA聚合酶核酸外切酶活性和校讀功效以及復制后修復系統(tǒng)對錯配加以糾正第17頁DNA復制酶學和拓撲學Enzymology and topology of DNA replication第二節(jié)第18頁參加DNA復制物質(zhì):底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶(polymerase): 依賴DNADNA聚合酶，簡寫為 DNA-pol模板(template): 解開成單鏈DNA母鏈引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP能夠依次聚合其它酶和蛋白質(zhì)因子第19頁(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi第20頁一、DNA聚合酶催化

7、脫氧核苷酸間聚合全稱：依賴DNADNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡稱：DNA-pol活性： 1. 53聚合活性 2. 核酸外切酶活性第21頁核酸外切酶活性: 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5?35外切酶活性: 能識別錯配堿基對，并將其水解53外切酶活性: 能切除突變 DNA片段第22頁（一）原核生物有3種DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第23頁DNA-pol DNA-pol DNA-pol

8、分子量（kD）109120250組成單肽鏈？多亞基不對稱二聚體分子數(shù)/細胞400？2053核酸外切酶活性有無無基因突變后致死性可能不可能可能原核生物DNA聚合酶第24頁個關(guān)鍵酶1個-復合物（、 6種亞基）1對-亞基（可滑動DNA夾子）全酶結(jié)構(gòu)包含：DNA聚合酶全酶結(jié)構(gòu):第25頁亞基（130 000）主要功效是合成DNA亞基含有35外切酶活性（復制保真性所必需）亞基可增強其活性亞基可能起組裝作用關(guān)鍵酶由、和亞基組成：兩側(cè)亞基發(fā)揮夾穩(wěn)DNA模板鏈，并使酶沿模板滑動作用第26頁2個-亞基分別和1個關(guān)鍵酶相互作用，其柔性連接區(qū)能夠確保在復制叉1個全酶分子2個關(guān)鍵酶能夠相對獨立運動，分別負責合成前導鏈和

9、后隨鏈功效：有促進全酶組裝至模板上及增強關(guān)鍵酶活性作用 -復合物由6種亞基組成：、第27頁對復制中錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)空隙進行填補功效：DNA-pol （109kD）:第28頁323個氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604個氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是試驗室合成DNA，進行分子生物學研究中慣用工具酶 第29頁DNA-pol （120kD）:DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活DNA-pol 對模板特異性不高，即使在已發(fā)生損傷DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。所以認為，它參加

10、DNA損傷應急狀態(tài)修復第30頁（一）常見真核細胞DNA聚合酶有5種DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性DNA-pol 參加低保真度復制 DNA-pol 在線粒體DNA復制中起催化作用DNA-pol 合成后隨鏈DNA-pol 合成前導鏈第31頁E.Coli真核細胞 功效填補復制中DNA空隙，DNA修復和重組復制中校對，DNA修復DNA修復線粒體DNA合成前導鏈合成DnaG引物酶后隨鏈合成真核生物和原核生物DNA聚合酶比較 第32頁DNA-pol 分子量（kD）16.54.014.012.525.553聚合活性中？高高高35核酸外切酶活性-+功效起始引發(fā)，引物酶活性低保真度復制線粒體DNA復制合

11、成后隨鏈合成前導鏈真核生物DNA聚合酶第33頁二、DNA聚合酶堿基選擇和校對功效DNA復制保真性最少要依賴三種機制:恪守嚴格堿基配對規(guī)律聚合酶在復制延長時對堿基選擇功效復制犯錯時有即時校對功效第34頁（一）復制保真性依賴正確堿基選擇利用“錯配”試驗發(fā)覺，DNA pol 對核苷酸參入（incorporation）含有選擇功效 DNA pol 對不一樣構(gòu)型糖苷鍵表現(xiàn)不一樣親和力，所以實現(xiàn)其選擇功效 第35頁（二）聚合酶中核酸外切酶活性在復制中識別切除錯配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈末端把核苷酸依次水解出來酶，外切酶是有方向性 A：DNA-pol外切酶活性切除錯配

12、堿基；并用其聚合活性摻入正確配正確底物B：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性DNA pol 校讀功效第36頁三、復制中DNA 分子拓撲學改變DNA分子堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。 第37頁蛋白質(zhì)（基因）通用名功能DnaA（dnaA）識別復制起始點DnaB（dnaB）解旋酶解開DNA雙鏈DnaC（dnaC）運輸和協(xié)同DnaBDnaG（dnaG）引發(fā)酶催化RNA引物生成SSB單鏈結(jié)合蛋白/DNA結(jié)合蛋白穩(wěn)定已解開單鏈DNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶又稱促旋酶解開超螺旋原核生物復制中參加DNA解鏈相關(guān)蛋白質(zhì)（一）各種酶參加DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)第38頁解螺旋酶(he

13、licase) 利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase) 復制起始時催化生成RNA引物酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈完整第39頁解鏈過程中正超螺旋形成第40頁復制過程正超螺旋形成：ABCDNA只固定一端DNA兩端固定解開10個堿基對（一個螺旋）DNA將會旋轉(zhuǎn)一圈DNA形成一個超螺旋解開10個堿基對（一個螺旋）蛋白分子DNA負超螺旋開口易化正超螺旋開口受阻第41頁拓撲異構(gòu)酶作用特點:既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構(gòu)酶分類及作用機制： 拓撲

14、異構(gòu)酶：切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當 時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP 拓撲異構(gòu)酶：切斷DNA分子兩股鏈，斷端經(jīng)過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛 利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)第42頁拓撲酶作用方式：第43頁四、DNA連接酶連接復制中產(chǎn)生單鏈缺口連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰DNA鏈連接成一條完整鏈DNA連接酶(DNA ligase)作用方式：第44頁DNA連接酶作用：第45頁功效:DNA連接酶在復制中起最終接合缺口作用在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用也是基因工程主要工具酶

15、之一第46頁DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成比較 提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長中新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復制中不連續(xù)兩條單鏈不連續(xù)連續(xù)鏈拓撲酶切斷、整理后兩鏈改變拓撲狀態(tài)第47頁原核生物DNA復制過程DNA replication in prokaryotes第三節(jié)第48頁起始是復制中較為復雜步驟，在此過程中，各種酶和蛋白因子在復制起始點處裝配引發(fā)體，形成復制叉并合成RNA引物 需要處理兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端一、復制起始第49頁原核生物復制起始部位及解鏈 （此圖

16、有誤需修改）（此圖錯誤部分包含文字和少了一個9bp重復序列已在圖中標注，請編輯幫忙修改）第50頁 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3535（二）引物合成和起始復合物形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域復合結(jié)構(gòu)稱為起始復合物第51頁起始復合物和復制叉生成第52頁3535引物是由引物酶催化合成短鏈RNA分子引物3 HO5引物酶第53頁二、DNA鏈延長復制延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延長中子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵不停生成 第54頁 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP

17、OH 33DNA-pol第55頁領(lǐng)頭鏈合成：領(lǐng)頭鏈子鏈沿著53方向能夠連續(xù)地延長第56頁后隨鏈合成第57頁 在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈第58頁第59頁原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制復制片段在復制終止點(ter)處匯合oriter E.coli8232 ori terSV40500三、復制終止第60頁555DNA-pol OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA連接酶子鏈中RNA引物被取代第61頁第62頁真核生物DNA復制過程Eukaryotic DNA replication process第四節(jié)第63頁真核生物與原核生物DNA復制差異：真核生物復制子多、岡

18、崎片段短、復制叉前進速度慢等DNA復制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換切除岡崎片段RNA引物是核酸酶RNAse H和FEN1等 第64頁哺乳動物細胞周期DNA合成期G1G2SM細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。G1S及G2M調(diào)整，與蛋白激酶活性相關(guān) 蛋白激酶經(jīng)過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用 第65頁真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同時開啟 復制起始需要DNA-pol （引物酶活性）、pol 和pol 參加。還需解螺旋酶活性、拓撲酶和復制因子(replication factor, RF) 一、真核生物復

19、制起始與原核基本相同第66頁酵母復制起點為自主復制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色體含有多個復制起點。元件A(富含A/T共有序列)：結(jié)合一個特異蛋白質(zhì)復合物復制起點識別復合物(ORC) 3個序列(B1、B2和B3)能夠增加復制起點效率，其中B29個堿基與上述ARS共有序列相同酵母復制起始點第67頁拓撲異構(gòu)酶，去除負超螺旋（使解旋酶輕易解旋），去除復制叉前方產(chǎn)生正超螺旋Tol和TolDNA雙螺旋解鏈，參加組裝引發(fā)體DNA解旋酶連接岡崎片段DNA連接酶核酸酶，切除RNA引物RNAse H核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA復制，核苷酸

20、切除修復，堿基切除修復Pol /合成RNA-DNA引物Pol /引發(fā)酶有依賴DNAATPase活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶， 促使PCNA結(jié)合于引物-模板鏈RFC激活DNA聚合酶和RFCATPase活性PCNA單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶輕易結(jié)合DNARPA功 能蛋白質(zhì)真核DNA復制叉主要蛋白質(zhì)功效第68頁現(xiàn)在認為pol 主要催化合成引物，然后快速被含有連續(xù)合成能力DNA pol 和DNA pol 所替換，這一過程稱為聚合酶轉(zhuǎn)換。DNA pol 負責合成后隨鏈，DNA pol 負責合成前導鏈。二、真核生物復制延長發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換第69頁前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期

21、后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換原因是Pol 不具備連續(xù)合成能力DNA聚合酶轉(zhuǎn)換關(guān)鍵蛋白是RFCDNA聚合酶/轉(zhuǎn)換第70頁真核DNA聚合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成第71頁3553前導鏈3535親代DNA后隨鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后馬上組裝成核小體第72頁染色體DNA呈線狀，復制在末端停頓復制中岡崎片段連接，復制子之間連接染色體兩端DNA子鏈上最終復制RNA引物，去除后留下空隙四、端粒酶參加處理染色體末端復制問題第73頁切除引物兩種機制第74頁線性DNA復制一次端?？s短 第75頁53355335+5333355第76頁端粒（telomeres）由富含TG重復序列組成人端

22、粒重復序列為5-(TnGn)x-3這些重復序列多為雙鏈，但每個染色體3端比5端長，形成單鏈ssDNA。這一特殊結(jié)構(gòu)可處理染色體末端復制問題第77頁組成：端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶(telomerase)第78頁端粒酶（telomerase）是一個核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白質(zhì)組成端粒酶以自己RNA組分作為模板，以染色體3端ssDN

23、A（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于染色體3端。這些新合成DNA為單鏈第79頁端粒酶催化作用爬行和端粒延長過程 第80頁真核全部染色體DNA復制僅僅出現(xiàn)在細胞周期S期，而且只能復制一次五、真核生物染色體DNA在每個細胞周期中只能復制一次第81頁前復制復合物在G1期形成而在S期被激活真核細胞DNA復制起始分兩步進行，即復制基因選擇和復制起點激活復制基因（replicator）是指DNA復制起始所必需全部DNA序列第82頁ORC最少募集兩種解旋酶加載蛋白Cdc6和Cdt1復制起點識別復合物（originrecognition complex，ORC）識別并結(jié)合復制基因三種蛋白質(zhì)一起募集真核細胞

24、解旋酶Mcm2-7前復制復合物（pre-RC）形成第83頁pre-RC激活和組裝真核DNA復制叉第84頁激活pre-RC，以起始DNA復制抑制形成新pre-RCCDK控制pre-RC形成和激活真核細胞經(jīng)過依賴細胞周期蛋白蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）嚴格控制pre-RC形成和激活Cdk功效：第85頁D-環(huán)復制（D-loop replication）是線粒體DNA復制形式六、真核生物線粒體DNA按D環(huán)方式復制dNTPDNA-pol 第86頁逆轉(zhuǎn)錄reverse transcription第五節(jié)第87頁逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription) 逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA以逆轉(zhuǎn)錄機制復制RNADNA第88頁逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA 模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA第89頁RNA病毒在細胞內(nèi)復制成雙鏈DNA前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細胞內(nèi)獨立繁殖。在一些情況下，前病毒