細(xì)胞凋亡、壞死、細(xì)胞活性檢查常見方式及試劑

1、線粒體膜電位指示染料線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡初期的一個(gè)標(biāo)志性事件.它在凋亡進(jìn)程中與caspase活化同時(shí)發(fā)生并先于磷脂酰絲氨酸（ PSS的外翻?；谝陨涎芯?，Biotium 研 發(fā)了各類的新型的熒光探針用于測量線粒體膜電位。MitoView ? 633MitoView ? 633是一種新型的用于測量線粒體膜電位的深紅染料（激發(fā)光/發(fā)射光622/648 nm）0利用NucView ? 488和MitoView ? 633凋亡檢測試劑盒能夠在熒光顯 微鏡（圖.1）或流式細(xì)胞儀（圖.2、3）下同時(shí)進(jìn)行線粒體膜電位和 caspase-3活性的檢測。圖1.利用MitoView ? 633進(jìn)行活細(xì)胞染

2、色：Hela細(xì)胞嚷嚷en-E0 ul-9wwlaJQn 一中=口中-修圖2.流式細(xì)胞儀分析：Jurkat細(xì)胞一組用CCC唯線粒體去極化，另一組利用staurosporine作為凋亡誘導(dǎo)劑。利用MitoView ?633染色bControltStaurospoiine01G11（P1（F1（F0 1中 1（F103FL1FL1圖3.流式細(xì)胞儀分析：對照（A）與經(jīng)staurosporine 處置（B）的Jurkat細(xì)胞（JC-1染色）.FL1 （x-軸） 為綠色熒光；FL2 （y-軸）為紅色熒光。（A圖）較高的紅綠熒光比例說明線粒體膜電位未下降 .（B圖） 較低的紅綠熒光比例說明： 由于staur

3、osporine誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生，細(xì)胞的線粒體膜電位大幅下降。JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1通常被用于檢測細(xì)胞中線粒體膜電位的轉(zhuǎn)變。在健康細(xì)胞中,JC-1以聚合體（J-aggregates）,的形式存在在線粒體基質(zhì)中，能夠產(chǎn)生紅色的熒光（激發(fā)光/發(fā)射光585/590nm）。相反，在正在凋亡或壞死的細(xì)胞中，JC-1不能聚集在基質(zhì)中，以單體的形式存在，從而發(fā)出綠色的熒光（激發(fā)光/發(fā)射光510/527nm）,如此能夠利用流式細(xì)胞儀 和熒光顯微鏡、熒光計(jì)數(shù)儀通過測量熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的轉(zhuǎn)變。經(jīng)常使用紅綠熒光的相對照例來衡量線粒體去極化的比例。通過 J C -1從紅色熒光到綠色 熒

4、光的轉(zhuǎn)變能夠很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，從而能夠用于初期的細(xì)胞凋亡檢測。Rhodamine 123Rhodamine123是一種綠色熒光染料（激發(fā)光/發(fā)射光505/534）,普遍用作 檢測線粒體膜電位（流式細(xì)胞儀檢測）。 TM R E和T M RM:四甲基羅丹明乙 脂或是甲基脂，是穿膜型的紅色熒光探針（激發(fā)光/發(fā)射光548/573 nm）,它們 很容易被線粒體攝取。這些熒光探針經(jīng)常使用于線粒體膜電位檢測（流式細(xì)胞儀 檢測）。DASPEIDASPEI是一種紅色的線粒體膜電位熒光染料（激發(fā)光/發(fā)射光461/589nm ）,被普遍用于高通量分析檢測。Dil C1（5）Dil C1（5） 是一種深

5、紅的羥花青染料（激發(fā)光/發(fā)射光638/658 nm）,常被 用于檢測凋亡細(xì)胞中的線粒體膜電位。MCB谷光音肽檢測試劑盒在細(xì)胞凋亡事件的初期，細(xì)胞質(zhì)中谷胱甘肽（GSH水平開始下降。細(xì)胞內(nèi) GSH的排除超級活躍時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能致使了凋 亡初期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中， 啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反映。MCB（Monochlorobimane）（激發(fā)光/發(fā)射 光380/461 nm）是一種熒光染料，在GST的作用下，它能夠與谷胱甘肽結(jié)歸并會(huì) 發(fā)出藍(lán)色熒光。能夠通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細(xì)

6、胞細(xì) 胞質(zhì)中谷光甘肽的減少來檢測凋亡初期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。（圖4）圖4. Jurkat圖4. Jurkat細(xì)胞別離以DMS處置（作為對照）和 1 uMstaurosporine 處置（凋亡誘導(dǎo)4小時(shí)）。利用MCB54U-Z口曲 Een-4ARFZ谷光普肽檢測試劑盒檢測其谷胱甘肽（GSH水平NucViewrM488 Caspase-3底物可在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)檢測caspase-3活性在凋亡初期的進(jìn)程中，caspase-3裂解對應(yīng)的胞漿胞核底物，致使了細(xì)胞在形態(tài)上 和生理生化功能上產(chǎn)生了一些列轉(zhuǎn)變。NucView ? 488 Caspase-3底物是一種穿膜型的熒光標(biāo)記的caspase底物，可

7、在活細(xì)月中實(shí)時(shí)檢測 caspase-3活性。傳統(tǒng)的熒光caspase底物不能用于活細(xì)胞的caspase活力檢測，因?yàn)槠湫枰呀饧?xì) 胞；其他的一些檢測手腕也僅僅只能檢測在一個(gè)細(xì)胞群落中caspase的平均活力?；跓晒鈽?biāo)記的caspase抑制劑的檢測技術(shù)（FLICA）能夠進(jìn)入活細(xì)胞檢測caspase活力，可 是熒光探針本身確實(shí)是不可逆轉(zhuǎn)的caspase抑制劑，因此無法在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)檢測caspase 的活力。 產(chǎn)品特性：?雙功能：許諾研究人員在凋亡細(xì)胞內(nèi)檢查 caspase-3的同時(shí)染色細(xì)胞核，顯示在細(xì)胞 核在凋亡進(jìn)程中經(jīng)歷的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變；?可不能阻礙caspase-3的活性，能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)檢測ca

8、spase-3 ；?直接加入細(xì)胞培育液即可快速染色，無需清洗殘余；?可用甲醛固定，兼容免疫染色；?可利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測;?兼容貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞。NucView ? 488 Caspase-3 底物是Biotium公司研發(fā)的用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測caspase-3活性的熒光探針，適用于熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀。這種底物 由一段大量帶負(fù)電荷的DEVD肽段與一種DNA結(jié)合染料連接而成。這種底物最初不能結(jié)合DNA也不能產(chǎn)生熒光，這種底物能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在那個(gè)地址被Caspase-3所剪切，從而釋放出和DNA高親和力的染料，釋放出的染料遷移進(jìn)入細(xì)胞核并將細(xì)胞

9、核染成亮綠色。（圖1、圖2）。圖1. NucView ? 488熒光底物檢測caspase活性的原理圖2.利用Staurosporine 誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡后，利用NucView ? 488 （活細(xì)胞caspase3檢測）（綠色）和 CF ? 594 Annexin V 染色（紅色）。NucViewrM488 Caspase-3活細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由貯存在 DMSOfr 的 NucVIEW? 488 Caspase-3 底物與 caspase-3 抑制劑 Ac-DEVD-CHCfi成.NucViewrM488 Caspase-3 底物別離以1mM濃度別離存儲在DMSOE是PBS中的形式提

10、供。DMSOC存形式NucView ? 488 Caspase-3 底物適用于一樣類型的細(xì)胞，PBS貯存形式針對DMSCM敏型的細(xì)胞。NucViewrM488 Caspase-3 底物與 CFTM594-Annexin V 雙凋亡檢測試劑盒是一種雙凋亡檢測方式試劑盒，包括用來檢測磷酸化絲氨酸（PS）轉(zhuǎn)位的深紅色熒光探針 CF594-annexin V 和Nucview 488 caspase-3 底物（圖.2）.NucViewrM488 與 MitoView tm633 凋亡檢測試劑盒包括了深紅熒光探針 MitoView ? 633 和 NucView ?488 Caspase-3 底物， 通

11、過熒光顯微鏡或是流式細(xì)胞儀可同時(shí)檢測線粒體膜電位與caspase-3活性。（圖.3）.二 z-sq swiii他凱比m ne-i hrFL144Mir寸 gtawnasgrrm*Fn Heionty 3tsuro$ponne-4hrFLI-Metqht -1 RCL 二 z-sq swiii他凱比m ne-i hrFL144Mir寸 gtawnasgrrm*Fn Heionty 3tsuro$ponne-4hrFLI-Metqht -1 RCL H零Hi| TOWpTi iTTfW1 1 演 103 104Fl 1-Klyhl圖2：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞在凋亡進(jìn)程中的caspase-3的活性和

12、線粒體膜電位（NucView ? 488和MitoView ? 633 凋亡檢測試劑盒）樣本：staurosporine誘導(dǎo)凋亡的Jurkat 細(xì)胞儀器：BD FACS Calibur flow cytometer.FL1 （x- 軸）：NucView ? 488 , FL4 （y- 軸）：MitoView ? 633 從圖中能夠看出，在凋亡進(jìn)程中，NucView488的熒光信號增強(qiáng)的同時(shí)線粒體膜電位在下降（ MitoView ? 633熒光探針檢測）Annexin V偶聯(lián)物Annexin V是一段35-36 kDa的磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有圖度親 和力。細(xì)胞發(fā)生凋亡初期，膜磷脂酰絲氨酸

13、（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡初期細(xì)胞的胞膜結(jié)合1。用熒光標(biāo)記的Annexin V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā) 生（圖.1、圖.2）。Biotium 提供了多種波段熒光標(biāo)記的annexin V偶聯(lián)物，其 標(biāo)記的熒光染料是Biotium 獨(dú)創(chuàng)的具有超高亮度和光穩(wěn)固性的 CF ?熒光探針，可 適用于各類凋亡和壞死細(xì)胞的檢測分析。J urk at圖1. Jurkat細(xì)胞凋亡檢測，NucView ? 488 （ J urk at圖1. Jurkat細(xì)胞凋亡檢測，NucView ? 488 （ 綠色）與CF647-Anne

14、xin V （ 品紅）染色Figure 2.流式細(xì)胞術(shù)分析：別離是未利用和利用staurosporine 誘導(dǎo)Jurkat cell 凋匚，利用NucView ?488 和CF647-Annexin V 染色。Apoptosis and necrosis quantitation kits咱們的凋亡/壞死定量檢測試劑盒包括了一對熒光探針：綠色的 CF488A-Annexin V和另一種非穿膜性的紅色核酸結(jié)合染料 （PI、7-AAD EthD-III ）。 由于其不能穿透細(xì)胞膜，因此關(guān)于有完整細(xì)胞膜的凋亡初期細(xì)胞不能染色， 而壞 死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞，其膜的完整性喪失，能夠被染色。將其與 CF

15、 ?488A-Annexin V匹配利用，能夠?qū)⒌蛲龀跗诘募?xì)胞和晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞 區(qū)分開來。Dual apoptosis assay kit咱們的雙凋亡檢測試劑盒包括用來檢測磷酸化絲氨酸（PS）轉(zhuǎn)位的深紅色熒光探針CF594-annexin V 和檢測 caspase-3 活性的 Nucview 488 caspase-3 底物。 足 夠在流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡上進(jìn)行至少 50次實(shí)驗(yàn)。凋亡與壞死定量檢測試劑盒Apoptosis & Necrosis Quantitation KitBiotium 的凋亡/壞死定量檢測試劑盒包括了一對熒光探針：綠色的 CF ? 488A-Annexin V和另

16、一種非穿膜性的核酸結(jié)合染料 （如：PI、7-AAD EthD-III ）。 由于其不能穿透細(xì)胞膜，因此關(guān)于有完整細(xì)胞膜的凋亡初期細(xì)胞不能染色，而壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞，其膜的完整性喪失，能夠被染色。將其與 CF ? 488A-Annexin V匹配利用，能夠?qū)⒌蛲龀跗诘募?xì)胞和晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞 區(qū)分開來。（圖.1）.Biotium 獨(dú)創(chuàng)的CF ? 488熒光染料在亮度和光穩(wěn)固性上遠(yuǎn) 超傳統(tǒng)的綠色熒光染料。CF?488-Annexin V和7-AAD（7-氨基放線菌素D）凋亡檢測試劑盒適用于熒光顯微鏡的凋亡檢測（圖.1）,因?yàn)?-AADft綠色熒光通道的溢出 效應(yīng)最小。而CF?488-Anne

17、xin V和Propidium Iodide （PI ,碘化丙噬）凋亡檢 測試劑盒推薦適用流式細(xì)胞儀（圖.2）.Apoptosis & Necrosis Quan titation Kit Plus包括 CF7488A-Annexin V 和 Ethidium homodimer III 熒光探針。Ethidium homodimerIII, （EthD-III ） 1,2是一種非穿膜性的核酸結(jié)合染料，這是由 Bioium 研發(fā)的新型探針，它和傳統(tǒng)的Propidium iodide （PI:碘化丙呢）相較，具有 更好的DN廉和性和更高的亮度。The Apoptotic, Necrotic, a

18、nd Healthy Cells Quantitation Kit那個(gè)試劑盒除 CF?488A-Annexin V口Ethidium homodimer III 一對熒光探針, 還包括了 Hoechst 33342,這是一種穿膜性的藍(lán)色DNABt染料（激發(fā)光/發(fā)射光350/461nm),從而實(shí)現(xiàn)凋亡、壞死、健康細(xì)胞的定量檢測Calcein-AM活細(xì)胞檢測試齊盒可用于活細(xì)胞定量檢測；動(dòng)物細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性檢測試劑盒中含有1對探針：calcein-AM 和ethidium homodimer III (EthD-3),綠色熒光的 CalceinAMS于胞內(nèi)脂酶活性檢測活細(xì)胞，而紅色熒光AMS于胞

19、內(nèi)脂酶活性檢測活細(xì)胞，而紅色熒光DNAfe料EthD-3基于膜完整性的破壞檢測死細(xì)胞。針(綠色)Annexin V and PI Apoptosis Kit進(jìn)行分析。活細(xì)胞為 針(綠色)Annexin V and PI Apoptosis Kit進(jìn)行分析?；罴?xì)胞為 Annexin V (-)/PI (-),初期凋亡細(xì)胞顯示為圖 1. Staurosporine誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞CF ? 488A -Annexin V 探針(綠色)與7-AAD圖 1. StaurosporineCF488A Antwxri VCFAMA Anntxm V圖2.流式細(xì)胞術(shù)分析Jurkat細(xì)胞：左圖為對照，右圖

20、利用1 uMstaurosporine 處置5小時(shí)，利用CF ? 488AAnnexinv V (+) / PI(-),凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞顯示為Annexin V (+) / PI (+)dUTP偶聯(lián)物與TUNEL試齊I盒在細(xì)胞凋亡中，染色體DNA的斷裂是一個(gè)重要的標(biāo)志事件1.凋亡細(xì)胞的 DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上顯現(xiàn)缺口會(huì)產(chǎn)生的一系列 DNA的3 -O筋尾，可在 脫氧核糖核甘酸結(jié)尾轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素或是生物素標(biāo)記的dUTP 偶聯(lián)物連接到斷裂DNA的3 -OH結(jié)尾，能夠通過流式細(xì)胞儀或是熒光顯微鏡檢 測到dUTP偶聯(lián)物發(fā)出的熒光。這確實(shí)是常說的TUNEL法（TdT介導(dǎo)的d

21、UTP缺口 結(jié)尾標(biāo)記技術(shù)）的原理。TUNEL法凋亡檢測是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方式，對完整的單個(gè) 凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué) 和形態(tài)特點(diǎn)，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培育的細(xì)胞和從組織中 分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一樣的 組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因此在細(xì)胞凋亡的研究中已被普遍采納。CF ?熒光標(biāo)記dUTP偶聯(lián)物Biotium 提供各類波段的CF ?熒光染料標(biāo)記dUTP偶聯(lián)物，用作直標(biāo)法TUNEL 凋亡檢測。咱們的 CF ? 488A 和CF ? 594 TUNEL Assay Apopto

22、sis Detection Kits包括完整的反映緩沖液、用于TUNEL標(biāo)記的TdT酶，和Biotium 獨(dú)創(chuàng)的具 有超高亮度和光穩(wěn)固性的綠色熒光 CF ? 488A和深紅色熒光CF ? 594偶聯(lián)的 dUTP整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)程，簡便、快速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀而且靈敏度高。生物素標(biāo)記的dUTP偶聯(lián)物Biotium 提供數(shù)種不同連接臂長度的生物素-dUTP偶聯(lián)物.這些偶聯(lián)物可 用于TUNEL法凋亡檢測，能夠利用熒光標(biāo)記的鏈霉親和素或是抗生物素的抗體進(jìn) 行顯色分析。一樣情形下，dUTPf生物素之間的連接臂長度越短，其與 DNA的 3 -OH結(jié)尾的連接效率越高，之間的連接臂長度越長，生物素與鏈霉親和素結(jié) 合

23、的效率越好。生物素與dUTP之間的數(shù)字說明其連接臂的長度，例如： biotin-11-dUTP 表示之間是11個(gè)原子的連接臂長度。ConltrolInduced Induced-no TdT圖 1. Jurkat 細(xì)胞無處置（對照），1 uMstaurosporine誘導(dǎo)凋亡 3 小時(shí)，CF ? 488 TUNELAssayApoptosisDetection Kit染色分析，利用 DAPI （藍(lán)色）共染色。活性染料與凋亡誘導(dǎo)劑活性染料Biotium 獨(dú)創(chuàng)的RedDot ? 2非穿膜性的核酸結(jié)合染料，能夠基于細(xì)胞膜完整性選擇性的對細(xì)胞核進(jìn)行染色。RedDot ? 2也能夠作為透性化細(xì)胞、固定細(xì)

24、胞或組織切片的核酸復(fù)染劑。Ethidium homodimer III 1,2 (EthD- III )是一種非穿膜性的核酸結(jié)合染料，這是由Bioium研發(fā)的新型探針，它和傳統(tǒng)的P ropidium iodide (PI:碘化丙呢)相較，具有更好的 DNA親和性和更 高的亮度。Biotium提供多種的非穿膜性的核酸熒光染料，可基于細(xì)胞膜的完整性來 標(biāo)記細(xì)胞。包括EthDIII、7-AAD和PI。咱們也提供各類穿膜性活細(xì)胞染色的核 酸熒光探針，包括深紅的RedDot ?核酸染料，Hoechst染料，和acridine orange (AO Y噬橙)，這些染料與ethidium bromide (

25、EB) 聯(lián)合利用，可用作活細(xì) 胞與死細(xì)胞的鑒定。凋亡誘導(dǎo)劑化學(xué)凋亡誘導(dǎo)劑在細(xì)胞凋亡的研究中有著普遍的應(yīng)用。Staurosporine 是一種非特異性的蛋白激酶抑制劑，能夠誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞凋亡。咱們也提供 ionomycin, 一種鈣離子載體，它能夠通過激活鈣蛋白酶來誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生?；罴?xì)胞定量檢測Biotium公司提供數(shù)種用于細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性查驗(yàn)試劑盒，他們依照不 同的原理檢測細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性的不同方面。Calcein-AM活細(xì)胞定量檢測試劑盒Calcein-AM是一種胞漿熒光標(biāo)記物，本身無熒光。Calcein-AM 由于在Calcein（鈣黃綠素）的基礎(chǔ)上增強(qiáng)了疏水性，因此能夠輕易穿透

26、活細(xì)胞膜。當(dāng)其 進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會(huì)將其水解為 Calcein（鈣黃綠素）留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng) 綠色熒光。與其它同類試劑相較，Calcein-AM是超級適合作為熒光探針去染活 細(xì)胞的，因?yàn)镃alcein（鈣黃綠素）可不能抑制任何的細(xì)胞功能如增殖或淋巴球 的趨化性，因此它的細(xì)胞毒性很低。Calcein-AM活細(xì)胞檢測試劑盒可用于活細(xì)胞定量檢測；動(dòng)物細(xì)胞存活率和細(xì)胞 毒性檢測試劑盒中含有1對探針：calcein-AM 和ethidium homodimer III（EthD-3）,綠色熒光的Calcein AM基于胞內(nèi)脂酶活性檢測活細(xì)胞，而紅色熒 光DNA染料EthD-3基于膜完整性的破壞檢測死細(xì)胞。關(guān)于活的或死的細(xì)菌細(xì)胞的檢測，請利用細(xì)菌細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性檢測試 劑盒（Cat#30027）,它一樣提供了兩種熒光的染色。Resazurin （刃天青），MTT,與XTT細(xì)胞活性檢測試劑盒 MTT, XTT,和resazurin （又名：Alamar Blue ?阿爾瑪藍(lán)）都能被活細(xì)胞線粒體所代謝而產(chǎn)生熒光物質(zhì)， 利用熒光或吸光度測量，可檢測這種轉(zhuǎn)變，從而檢測細(xì)胞活性和定量活細(xì)胞數(shù)量。MTT、XTT在活細(xì)胞中會(huì)被代謝成有色的formazin鹽，能