流式細(xì)胞術(shù)課件

1、關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)課件課件課件第一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)概述第二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選第三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。 細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)第四張，PP

2、T共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀 是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。第五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月BD LSR第六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月通過(guò)流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息 - 相對(duì)細(xì)胞大小 - 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 - 染色過(guò)細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度第七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核-特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA,

3、RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子, PH值, 膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性第八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基礎(chǔ)研究 淋巴細(xì)胞功能、樹突狀細(xì)胞（DC）研究、造血干細(xì)胞研究、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡分析、凋亡相關(guān)蛋白分析、細(xì)胞功能研究、多藥耐藥基因研究（MDR）、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)研究、RNA測(cè)定、DNA測(cè)定、總蛋白測(cè)定、癌基因和抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定、血管內(nèi)皮細(xì)胞研究第九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月臨床研究 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定、血小板分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中應(yīng)用、細(xì)

4、胞因子測(cè)定、AIDS診斷與治療和療效評(píng)價(jià)、flow-FISH法測(cè)定端粒長(zhǎng)度第十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié)流式細(xì)胞儀工作原理第十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。 一、工作原理 第十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本工作原理第十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化

5、管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過(guò)程第十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月區(qū)別流式細(xì)胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等承載工具鞘液及流動(dòng)室載玻片檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)，5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡(jiǎn)單，單參數(shù)流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別第十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月現(xiàn)代流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng) 聚焦細(xì)胞以供檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)和收集光信號(hào) 電子系統(tǒng) 將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信

6、號(hào)，并使其數(shù)字化以供計(jì)算機(jī)分析細(xì)胞分選系統(tǒng) 第十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色 受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。1. 液流系統(tǒng)第十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處第十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噴嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖第十九張，

7、PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管第二十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過(guò)短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）2. 光學(xué)系統(tǒng)第二十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光學(xué)系統(tǒng)示意圖第二十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （

8、1）激光光源單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光最多檢測(cè)13個(gè)熒光參數(shù) 第二十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Optical Filters460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP500/50LongpassShortpassBandpass第二十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）第二十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

9、6月流式細(xì)胞儀的光信號(hào)散射光信號(hào)熒光信號(hào)第二十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(2) 散射光信號(hào)前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信號(hào)細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積。 側(cè)向角散射（SSC, Side Scatter）入射激光90角的散射光信號(hào)細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性。第二十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月前向角散射光 FSCForward Angle Light ScatterFALS SensorLaser第二十九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月側(cè)向角散射光SSCSide ScatterFALS Sensor90

10、LS SensorLaser第三十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月散射光散射光能被用來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異 -通常使用“散點(diǎn)圖”來(lái)看散射光信號(hào) -散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)第三十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月散點(diǎn)圖Dot Plotlysed whole blood第三十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒

11、別出某些亞群 第三十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器（3）熒光測(cè)量第三十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光信號(hào)熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動(dòng)能和熱能釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)第三十五張，P

12、PT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙色熒光散點(diǎn)圖第三十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光檢測(cè)器FluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)第三十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光補(bǔ)償?shù)谌藦?，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月光譜交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection兩色以上熒光分析存在 光譜交叉第三十九

13、張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光補(bǔ)償方法所有補(bǔ)償調(diào)為“0”調(diào)節(jié)電壓，用同型對(duì)照或陰性對(duì)照，使陰性群位于“左下角”依單陽(yáng)群體調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償?shù)谒氖畯垼琍PT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月調(diào)與未調(diào)補(bǔ)償FL1FL2第四十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意！用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)腇ITC、PE抗體必須有明顯的陽(yáng)性信號(hào)，否則就不會(huì)出現(xiàn)熒光滲漏現(xiàn)像，調(diào)節(jié)補(bǔ)償也無(wú)從入手。在正式數(shù)據(jù)采集前要調(diào)整好補(bǔ)償，一旦數(shù)據(jù)被獲取，BD、Coulter儀器無(wú)法再改變補(bǔ)償partec流式細(xì)胞儀提供軟件調(diào)節(jié)補(bǔ)償技術(shù)，無(wú)論何時(shí)都可重新調(diào)節(jié)多色熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)方法同雙色法第四十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，

14、創(chuàng)作于2022年6月主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成3. 電子系統(tǒng)第四十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 細(xì)胞分選系統(tǒng)第四十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第四十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示第四十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:

15、點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置數(shù)據(jù)顯示方式第四十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少 參 數(shù)第四十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖第四十九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel )X軸：代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的強(qiáng)度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強(qiáng)度

16、之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞的頻率第五十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖第五十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不同的細(xì)胞群可以用不同的顏色標(biāo)記主要表達(dá)方式第五十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 二維等高

17、圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。第五十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二維等高圖第五十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 假三維等高圖第五十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三參數(shù)直方圖第五十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析第五十七張，PPT

18、共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月數(shù)據(jù)分析設(shè)門設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)第五十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設(shè)門分析技術(shù)第五十九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A 淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門第六十張，PPT共一百二十五

19、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月線性門第六十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Region設(shè)置: 區(qū)閾（region, R）與門(gate, G ) 是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門。第六十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 第六十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié)流式細(xì)胞樣品制備第六十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本來(lái)源：外周血、骨髓、組織塊、

20、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他實(shí)驗(yàn)的不同，選用不同的抗凝劑。EDTA： 2mg/ml枸椽酸鈉：0.38%肝素：15IU/ml可選的抗凝劑有：第六十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本處理時(shí)間：新鮮樣本分析時(shí)，樣本采集后應(yīng)立即分析樣本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分鐘。注：不同的實(shí)驗(yàn)，所用的固定方法不完全相同。第六十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣本處理標(biāo)準(zhǔn)試劑：一、10%Bovine Serum Albumin BSA1. 溶解10g BSA至100ml蒸餾水中2. 4C，20000 g離心30分鐘3. 分裝后-20C保存第六十七張，PPT共一百二

21、十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、0.1% BSA-PBS緩沖液 1. 準(zhǔn)備500ml，PH7.3 PBS2. 加入5ml 10% BSA3. 使用0.45um濾網(wǎng)過(guò)濾三、氯化銨溶血?jiǎng)?1. 在一升蒸餾水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 調(diào)節(jié)PH值至7.23. 在使用前配置該溶血?jiǎng)?，并?.45um濾膜過(guò)濾第六十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法一：溶血法取100 ul抗凝全血；2. 快速加入 2ml NH4CL溶血?jiǎng)?混勻；3. 室溫孵育5分鐘；4. 4C，400g離心10分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；5. 4C，40

22、0g離心10分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；6. 4C，400g離心10分鐘。去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x106/ml。收集白細(xì)胞第六十九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法二：密度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞 Histopaque 1077為Ficoll與Sodium diatrizoate(泛影酸鈉)混合物，其密度為1.1191.077。通過(guò)離心可將全血中的粒細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離。粒細(xì)胞沉積于1.1191.077的血漿層，而單個(gè)核細(xì)胞則在1.077以下的血漿層中。第七十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1. 準(zhǔn)備2ml抗凝血（根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定用血量）， 等量PB

23、S稀釋；2. 準(zhǔn)備1ml Histopaque 1077 (Sigma)；3. 室溫下700g離心30分鐘；4. 仔細(xì)將含有單個(gè)核細(xì)胞血漿層吸出；5. 加4ml BSA-PBS，400g離心10分鐘；6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。操 作第七十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織由于結(jié)構(gòu)松散，容易分離成單個(gè)細(xì)胞。一般對(duì)樣本進(jìn)行切剪、研磨、過(guò)濾便可。從組織獲取淋巴細(xì)胞將樣本置于陪替氏培養(yǎng)皿，加入15ml BSA-PBS；將樣本切成3-4mm3大小，用鑷子將其分離；將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾，用密度法分離、提純淋巴細(xì)胞。方 法：第七十二張，PPT共一百

24、二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月其他標(biāo)本：通常在其他組織中分離淋巴細(xì)胞需用酶進(jìn)行消化。對(duì)于不同標(biāo)本，處理方法也各不相同。第七十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第七十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗體染色一般方法外周血白細(xì)胞分析：100ul全血血小板分析：15ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量）紅細(xì)胞分析：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細(xì)胞數(shù)稀釋后使用）骨髓：100ul其他樣本，計(jì)數(shù)后決定使用體積目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測(cè)終濃度：1106/ml第七十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

25、細(xì)胞計(jì)數(shù)方法傳統(tǒng)手工計(jì)數(shù)：耗時(shí)、準(zhǔn)確度差流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)：BD，Coulter儀器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec儀器:最為精密的細(xì)胞計(jì)數(shù)器，直接報(bào)告細(xì)胞濃度第七十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反應(yīng)體積樣本中加完抗體后， 1106細(xì)胞反應(yīng)體積應(yīng) 不小于100ul。第七十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月上機(jī)檢測(cè)樣本染色及溶血過(guò)程處理完后應(yīng)立即上機(jī)檢測(cè)打開流式細(xì)胞儀：預(yù)熱及進(jìn)行質(zhì)控程序選擇相應(yīng)的方案或新建方案加載或重新調(diào)節(jié)各參數(shù)上樣檢測(cè)第七十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié)流式細(xì)胞熒光標(biāo)記第七十九張，PPT共一

26、百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月選擇合適的熒光染料必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少第八十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗體使用原則根據(jù)儀器型號(hào)和抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇熒光抗體低表達(dá)抗原標(biāo)記高S/N（信噪比）熒光素，如PE、APC使用雙標(biāo)以上抗體必做熒光補(bǔ)償?shù)诎耸粡垼琍PT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類幾種常見(jiàn)的熒光染料第八十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)

27、作于2022年6月名稱染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠 525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texas red568紅 615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料第八十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒

28、光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料第八十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制第八十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo):干擾少,但需購(gòu)買多種單抗間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記第八十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠

29、微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測(cè)特產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有“液相芯片”之稱 。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用第八十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來(lái)編碼）第八十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月通過(guò)對(duì)標(biāo)記不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)FCM對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析第九十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié)流式細(xì)胞術(shù)質(zhì)

30、量控制第九十一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細(xì)胞實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法溫度2537，pH7.07.2（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控第九十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月溫度pH染料濃度固定劑（二）免疫熒光染色的質(zhì)控第九十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn): 保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn): 保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）儀器操作的質(zhì)控第九十四張，PPT共一百二十五頁(yè)

31、，創(chuàng)作于2022年6月同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測(cè)，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)控第九十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月關(guān)于同型對(duì)照例：一個(gè)雙色染色的實(shí)驗(yàn) 抗體A FITC，抗體B PE 對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要準(zhǔn)備的是陰性對(duì)照：細(xì)胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE單陽(yáng)性對(duì)照： FITC: 細(xì)胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 細(xì)胞加上Ab B PE, IgG1 FITC第九十六張，PPT共

32、一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)第九十七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Apoptotic Cell Death - a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis第九十八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death細(xì)胞散射光 在細(xì)胞調(diào)亡中，細(xì)胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒(méi)有明顯

33、變化第九十九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百?gòu)垼琍PT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death熒光吸收細(xì)胞的胞膜對(duì)于DNA染料的通透性和細(xì)胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞第一百零一張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell deathFCM of Caspases通過(guò)抗體和活化的caspase-3片斷相結(jié)合來(lái)檢測(cè) 使用特異性的caspase-3熒光底物新的抗原決定

34、基CK18第一百零二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百零三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death線粒體功能的變化 TMP會(huì)在調(diào)亡中產(chǎn)生，可以通過(guò)一些標(biāo)記用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用有膜穿透性的親脂性陽(yáng)離子熒光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作為流式檢測(cè)的探針。 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，一個(gè)線粒體膜表面蛋白7A6抗原會(huì)出現(xiàn)Bcl-2/bax family of proteins. 第一百零四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百零五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作

35、于2022年6月第一百零六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death鈣離子流和 pH值變化 胞漿內(nèi)Ca2+ 水平的上升和由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化造成的選擇性的pH值的調(diào)節(jié)降低是伴隨著細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的后果之一。使用Ca2+ 選擇性熒光探針，如 Quin-2, Fluo-3, Indo-1 通過(guò)流式檢測(cè)是測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的最佳方案酸化的檢測(cè)同樣可以用對(duì)pH敏感的熒光探針，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等進(jìn)行檢測(cè) 第一百零七張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow

36、 cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution第一百零八張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百零九張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell deathDNA 鏈的斷裂細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA片段。 斷裂的末端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。第一百一十張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十一張，PPT

37、共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十二張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十三張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death細(xì)胞DNA含量 在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過(guò)流式檢測(cè)DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。第一百一十四張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Flow Cytometry of Apoptotic CellsPI - Fluorescence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells第一百一十五張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第八節(jié)流式細(xì)胞術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用第一百一十六張，PPT共一百二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。 一、