中藥現代化技術

1、收稿日期：2018-00-00;定用日期：2018-00-00;DOI：10.13550/j.jxhg.20180391基金項目：陜西省教育廳重點實驗室項目（14JS024）；陜西省社會發(fā)展科技攻關項目（2016SF-347）；陜西省教育廳專項資助項目（14JK1194）；陜西中醫(yī)藥大學校內基金（14XJZR11）作者簡介 趙鵬（1977- ），男，山西臨猗人，教授，博士。研究方向為天然藥用活性成分分離純化。E-mail： HYPERLINK mailto:zhaopeng65 zhaopeng65聯系電話中藥現代化技術混合磷酸鹽法制備款冬花磷酸酯多糖20180530

2、0391趙鵬，張麗華，王國全，張婷婷（陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西咸陽 712046）摘要:以款冬花多糖為原料，采用混合磷酸鹽法制備了款冬花磷酸酯多糖。以磷酸基的取代度（DS）為指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對款冬花多糖磷酸酯化的合成工藝進行了優(yōu)化。結果表明，最優(yōu)合成工藝條件為：反應時間6.0h，反應溫度86，尿素用量為反應物總質量的14.25%，m混合磷酸鹽（磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉）:m（款冬花多糖）=1.5:1，m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2.0:1。在此條件下制備的款冬花多糖磷酸酯，DS平均值為0.697?？寡趸詫嶒灲Y果表明：款冬花多糖磷酸酯對DPPH最大清除率為98.

3、91%，O2-最大清除率為48.85%，OH最大清除率為50.34%，均高于款冬花多糖。關鍵詞:款冬花；磷酸酯多糖；混合磷酸鹽法；合成工藝；抗氧化性；中藥現代化技術中圖分類號：TQ28 文獻標識碼：A文章編號：1003-5214 (2018) 00-0000-00Synthesis of Phosphorylated Polysaccharides from Tussilagofarfara by Mix-phosphate MethodZhao Peng, Zhang Li-hua, Wang Guo-quan, Zhang Ting-ting(School of Pharmacy, Sha

4、an Xi University of Chinese Medicine, Xian Yang 712046)Abstract:Phosphorylated polysaccharides from Tussilagofarfara was synthesizedby mix-phosphate method.The synthetic process conditions was optimized via the response surface method. The research results show that 6.0h, 86, 14.25% of urea2.0 of ma

5、ss ratio of mix-phosphate, 1.5 of mass ratio of mix-phosphate and polysaccharides were the optimum conditions. The DS of phosphorylated polysaccharides from Tussilagofarfara was 0.697. The antioxidant ability of phosphorylated polysaccharides from Tussilagofarfara had been improved.Its maximum remov

6、al rate for DPPH,O2-and OHwas 98.91 %,48.85 %,50.34 %.Key words: Tussilagofarfara; phosphorylatedpolysaccharides; mix-phosphate method; synthesis process; antioxidant activity; modernization technology of traditional Chinese medicinesFoundation items:Educational Commission of Shaanxi (14JS024); Soci

7、al Development by Department of Science and Technology of Shaanxi (2016SF-347);Shaanxi Provincial Department of Education Funding Project(14JK1194); FoundationofShaanxiUniversityofChineseMedicine(14XJZR11).多糖廣泛存在于動植物體內，具有抗腫瘤1、調節(jié)機體免疫2-3、降血糖4、抗肝損傷作用5等活性。通過化學合成法對某些多糖的結構進行修飾，能夠改變其生物利用度和生物活性，這是深化對糖類藥物開發(fā)的

8、重要途徑之一6-9。磷酸酯化是對糖類分子進行結構修飾的重要方法，一些不具有生物活性或活性較弱的多糖經磷酸酯化后其活性得到明顯改善，尤其是增強了其抗腫瘤10、抗輻射11-12、抗氧化性13等活性。款冬花是菊科植物款冬（Tussilagofarfara L.）的干燥花蕾，臨床上用于治療慢性支氣管炎（氣管炎）、咳嗽氣喘等疾病，主要分布于陜西、寧夏、河北、甘肅等地14-17。款冬花多糖是款冬花中重要的活性成分之一，有研究報道其具有一定的抑制白血病K562細胞和抗氧化活性，但活性相對較弱18-19。目前對款冬花多糖化學修飾改性的研究較少。鑒于此，本文以陜西道地藥材款冬花中的多糖成分為原料，采用混合磷酸鹽

9、法，合成得到了款冬花磷酸酯多糖，并采用響應面法優(yōu)化其合成工藝，同時初步探討了其抗氧化活性。旨在為款冬花多糖及其衍生物進行進一步開發(fā)成新的藥品提供一定的理論依據。1實驗部分1.1材料與試劑款冬花購自西安市萬壽路中藥材批發(fā)市場，經陜西中醫(yī)藥大學王國全博士鑒定為菊科植物款冬（TussilagofarfaraL.）的干燥花蕾。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、尿素、鉬酸銨、抗壞血酸，AR，天津科密歐化學試劑有限公司；1,1二苯基苦基苯肼，BR，日本東京仁成工業(yè)株式會社；LS-206大孔吸附樹脂（弱極性，粒徑0.31.25mm），西安藍深特種樹脂有限公司。OSB-2100型旋轉蒸發(fā)儀、DZ5-WS型低

10、速臺式離心機、HB-型循環(huán)水式真空泵，上海愛朗儀器有限公司；GZX-DH.500BS型電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機，德國CHRIST公司；722N型可見分光光度計，上海鼎科科學儀器有限公司；BSA224S型分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。1.2實驗方法1.2.1款冬花多糖的制備按照文獻20方法，將在干燥箱中80下干燥后的100g款冬花脫脂后粉碎成60目顆粒，21mL水中加入1g款冬花顆粒，在84下提取3次，提取液過濾后按1g款冬花顆粒濃縮成1mL溶液，濃縮液采用木瓜蛋白酶結合Sevage法20脫蛋白后，再用LS-206大孔吸附樹脂進行脫

11、色處理，脫色液按1g款冬花顆粒濃縮成1mL溶液，濃縮后用4倍體積的無水乙醇醇沉離心后，-20下凍干24h，即得1.24g灰白色粗多糖。粗多糖用50mL去離子水復溶后，在截留分子量為3.5 kDa的透析袋中用流動的自來水透析48h，去離子水透析24h；透析液上DEAE-ecllulose柱（30 mm300mm）純化，收集富集成分濃縮至25mL，再用Sephadex G-200凝膠柱（15 mm300mm）純化，共分得3個組分，選擇其中洗脫峰面積最大的組分，濃縮凍干后得到白色粉末狀款冬花多糖。經高效凝膠液相色譜檢測為均一多糖，糖含量是99.2%；分子量為5.5 kDa；該多糖為甘露糖和葡萄糖兩種

12、單糖組成，甘露糖與葡萄糖的物質的量比為1.7981。1.2.2 款冬花磷酸酯多糖的制備參照文獻21方法，并稍作修改。先精確稱取0.1g款冬花多糖樣品，加入5mL去離子水溶解，常溫下將制備的款冬花多糖水溶液、磷酸鹽（磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉按一定質量比混合）與適量催化劑尿素混合均勻。將混合物在水浴中加熱一定時間后取出，將反應液裝入截留分子量為3.5 kDa的透析袋中用流動自來水透析48h。透析液濃縮經冷凍干燥后即得淺褐色粉末狀款冬花磷酸酯多糖。1.2.3款冬花多糖磷酸酯化取代度的測定參照文獻21，測定磷酸酯化款冬花多糖的取代度。精確稱取磷酸二氫鉀（分析純）0.5000 g，用蒸餾水溶解后稀釋定容于

13、至100 mL的容量瓶中，震蕩使其混合均勻，配成5 g/L的標準磷溶液。精密吸取該溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分別移入9個50 mL的容量瓶中，依次分別加入10 mL 質量分數為26 %的硫酸溶液、5 mL質量分數 2 % 的鉬酸銨溶液、2 mL 質量分數為5 % 的抗壞血酸溶液，震蕩使其混合均勻，沸水浴加熱10 min，立即用冷水迅速冷卻，并定容至50 mL。在波長820 nm 處測定磷酸二氫鉀溶液的吸光度A，根據所得不同濃度溶液的吸光度值繪制標準曲線，所得回歸方程是：y = 0.0215x0. 0322，R2=0.9997 （1）根據磷

14、的標準曲線測得樣品中總磷質量分數和游離磷質量分數。結合磷質量分數按式（2）計算：結合磷質量分數=總磷質量分數-游離磷質量分數（2）取代度DS按式（3）計算：DS=（磷含量/31）/（100-3.32磷含量）/162=（5.23磷含量）/（100-3.32磷含量）（3）其中：162為款冬花多糖分子中單糖的摩爾質量，g/mol；31磷的摩爾質量，g/mol；3.32游離磷換算成結合磷酯基團的系數；磷含量為結合磷質量分數，%。1.2.4抗氧化能力的測試 清除DPPH實驗按照參考文獻方法20，進行清除DPPH實驗，配制不同質量濃度的款冬花多糖溶液、款冬花磷酸酯多糖溶液，分別加入4 mL 210-4mo

15、l/LDPPH的溶液作為樣品組；不加DPPH的多糖溶液作為對照組；配制4 mL 體積分數為60%乙醇溶液，再加入4 mL 210-4mol/LDPPH的溶液作為空白組，用可見光分光光度計在 = 517 nm 處的測定吸光度A，用下式計算DPPH清除率。DPPH清除率/%=1-（A樣品-A對照）/A空白100 （4）式中：A空白為空白組吸光度；A樣品為樣品組吸光度；A對照為對照組吸光度。 清除超氧根負離子實驗依據參考文獻方法20，采用鄰苯三酚自氧化法，其中樣品多糖溶液和鄰苯三酚溶液在50 mmol/L Tris-HCl（pH=8.2）緩沖液保溫20 min后加入，并快速搖勻，然后以Tris-HC

16、l緩沖液作空白對照，測定樣品在320 nm處的吸光值，每隔30s記錄一次，連續(xù)記錄4min。各管的氧化速率及對 O2-的清除率按下式計算：V=(A1-A0)/4 (5) 式中：V為氧化速率，min-1；A0為初始吸光度值；A1為終止吸光度值；4表示測試時間為4 min。清除率/%= (V自- V樣品)/ V自100 (6)式中：V自為不加多糖樣品氧化速率，min-1；V樣品為加多糖樣品氧化速率，min-1。清除羥自由基實驗依據文獻方法20，取5mmol/L鄰二氮菲溶液，加pH=7.4、50mmol/L的磷酸緩沖液2.0mL充分混勻后，加7.5mmol/L FeSO4溶液1.0mL，立即混勻，加

17、入質量分數為0.1 % H2O2 1.0mL，最后以H2O補充至總體積為10mL。37保溫1h，在536 nm處測吸光值A損傷。依上述方法，分別加入不同質量濃度多糖溶液后再加H2O2，然后加入2mmol EDTA 在37保溫1h，測A樣品。未損傷管不加H2O2及多糖溶液測A未損傷。OH清除率/% =(A樣品- A損傷)/(A未損傷- A損傷)100 (7)式中：A樣品為樣品組吸光度；A損傷為損傷組吸光度；A未損傷為未損傷組吸光度。2結果與討論2.1單因素實驗2.1.1磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉質量比對取代度的影響稱取款冬花多糖0.1 g加入10mL去離子水，混合磷酸鹽與款冬花多糖質量比為1，尿素為

18、反應物總質量的10%，于60反應5 h，考察磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的質量比對取代度的影響，結果見圖1。圖1磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉質量比對取代度的影響Fig.1 Effect of mass ratio of mix-phosphate on the DS從圖1可看出，當m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2：1時，此時得到的款冬花磷酸酯多糖的取代度最高，繼續(xù)增加質量比，取代度基本沒有變化，因此，確定m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2:1。2.1.2混合磷酸鹽與款冬花多糖質量比對取代度的影響在m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2：1，尿素為反應物總質量的10%，于60反應5 h，考察混合磷

19、酸鹽與款冬花多糖質量比對取代度的影響，結果見圖2。圖2混合磷酸鹽與款冬花多糖質量比對取代度的影響Fig.2 Effect of mass ratio of mix-phosphate and polysaccharides on the DS從圖2可看出，隨著混合磷酸鹽與款冬花多糖質量比的增加，款冬花多糖磷酸酯化的取代度快速增加，這說明較大的質量比有利于多糖接觸到更多的混合磷酸鹽，有利于反應的進行。當m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1.5：1時，款冬花磷酸酯多糖取代度最高，之后取代度不再發(fā)生變化，從節(jié)約成本的目的考慮，因此，確定m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1.5：1。2.1.3反應

20、溫度對取代度的影響在m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2：1，尿素為反應物總質量的10%，m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1.5:1，反應5 h，考察不同反應溫度對取代度的影響，結果見圖3。圖3 反應溫度對取代度的影響Fig.3 Effect of temperature on the DS從圖3可看出，款冬花多糖磷酸酯化的取代度隨著溫度的升高快速增加，對于酯化反應，溫度的升高有利于反應的進行。當反應溫度為80時，款冬花磷酸酯多糖的取代度最高，繼續(xù)提高反應溫度，取代度略有降低，說明較高的反應溫度，可能會造成款冬花磷酸酯多糖的水解，因此，確定反應溫度為80。2.1.4反應時間對取代度的影響

21、在m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2：1，尿素為反應物總質量的10%，m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1.5:1，80反應，考察不同反應時間對取代度的影響，實驗結果見圖4。圖4 反應時間對取代度的影響Fig.4 Effect of time on the DS從圖4可看出，隨著反應時間的增加，款冬花多糖磷酸酯化的取代度快速增加，這是因為反應時間的增加，使得酯化反應更加充分的緣故，當反應時間為6h時，取代度最高，隨后其取代度有所下降，這說明過長的反應時間，可能會引起款冬花磷酸酯多糖的水解，因此，確定反應時間為6h。2.1.5 尿素用量對取代度的影響在m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2

22、：1，m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1.5:1，于80反應6h，考察不同尿素用量對取代度的影響，結果見圖5。圖5尿素用量對取代度的影響Fig.5 Effect of urea on the DS從圖5可看出，隨著尿素用量的增加，款冬花磷酸酯多糖的取代度在不斷增加；當w（尿素）=15%時，取代度最高，之后取代度又出現了下降，這可能是由于尿素用量的增多，使得反應體系堿性增強，造成了款冬花磷酸酯多糖的水解，因此，確定尿素用量為反應物總質量的15%。2.2響應面實驗根據單因素實驗結果，當其他單因素確定后，在m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2：1，m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1:1，款

23、冬花磷酸酯多糖的取代度基本不變，說明這兩個因素對取代度的影響不大。因此，選擇反應時間、反應溫度和尿素用量為影響因素進行響應面優(yōu)化實驗，選擇的因素水平見表。響應面優(yōu)化實驗結果如表2所示。表1響應面實驗因素水平選擇表Table 1Factors and levels of the designed experiment因素水平-1 0 1反應時間X1/%567反應溫度X2/708090尿素用量X3/%101520注： A = (X1-6)/1，B=(X2-80)/10，C=(X3 -15)/5。表2 響應面分析實驗方案及結果 Table 2 Program and test results of

24、RSM編號X1X2X3取代度1670200.552670100.533780100.514770150.525790150.596690200.587580100.578590150.529690100.5410570150.4811680150.6812780200.5613680150.6714680150.6815580200.54表3方差分析表Table 3 Analysis of variance方差來源偏差平方和自由度均方FP模型0.04895.29010-3112.59 0.0001A1.36110-411.36110-42.900.1495B5.25310-315.25310-

25、3111.810.0001C5.78010-415.78010-412.300.0171AB1.32310-411.32310-42.810.1542AC2.60110-312.60110-355.360.0007BC1.00010-411.00010-42.130.2044A20.01810.018388.29 0.0001B20.01110.011240.26 0.0001C20.01510.015322.31 0.0001殘差2.34910-554.69810-5失擬誤差2.30210-437.67510-51.970.3544純誤差4.66710-622.33310-6總和0.0481

26、4注：表示無該項數據。根據表3的分析結果可知，通過Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的模型顯著性遠遠小于0.05(P0.0001)，說明該模型是高度顯著的，從失擬性檢驗結果來看，失擬誤差并不顯著（P=0.3544），這說明實驗中的未知因素對于實驗結果影響很小，預測的回歸模型與實際實驗結果擬合得較好。而且預測模型的R2 = 0. 9933，說明款冬花磷酸酯多糖的取代度實驗值與預測值之間的有著良好的一致性，該模型的變異系數CV=1.35%5%，校正系數R2Adj= 0. 9812這說明預測的模型能反映98.12%響應值的變化，因此通過回歸方程能夠預測實驗真實數據并對真實的實驗數據

27、進行分析和預測22-23。通過表3分析結果可知，各單因素中，對款冬花磷酸酯多糖取代度影響最大的是反應溫度，其次是尿素用量，最不顯著的是反應時間，反應時間與尿素用量之間的交互影響最為顯著。根據Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的回歸方程為：Y =0.68-4.12510-3A+0.026B+8.5010-3C+5.75010-3AB+0.025AC-5.0010-3BC-0.069 A2-0.054B2-0.062C2（8）通過 Box-Behnken實驗得到的多元回歸模型所做的響應曲面圖如圖6所示，響應面圖能夠直觀地反映各因素之間的交互關系，曲面越陡峭，說明該因素對響應值的影

28、響越顯著，從圖中的等高線密集程度可看出對取代度的影響，越密集說明影響越顯著，越稀疏表明影響越小。圖6 (a)反應溫度與反應時間、(b)反應時間與尿素用量和(c) 反應溫度與尿素用量對取代度的影響Fig.6 (a) Effect of temperatureand time on theDS, (b)Effect of timeand urea on the DS，(c) Effects of temperature and dosage of urea on theDS從圖6可以看出，反應溫度所對應的曲面最為陡峭，反應時間所對應的曲面相對最為平滑，這說明反應溫度對款冬花磷酸酯多糖取代度的影響最

29、顯著，反應時間的影響最小。根據Box-Behnken實驗擬合得到的回歸方程進行一階偏導，可得到：A=0.03，B=0.58，C=-0.15；根據回歸模型預測的款冬花磷酸酯多糖合成的最優(yōu)反應條件是：反應時間6.03h，反應溫度85.8，尿素用量為反應物總質量的14.25%，磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉質量比為2：1，混合磷酸鹽與款冬花多糖質量比為1.5:1，此時得到的款冬花磷酸酯多糖中取代度的預測值是0.693。按照實際的可操作性，將上述預測反應條件加以微調，即：反應時間6.0h，反應溫度86，尿素用量14.25%，磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉質量比為2：1，混合磷酸鹽與款冬花多糖質量比為1.5:1。按此工

30、藝條件，分別取款冬花多糖0.1g進行3次平行磷酸酯化反應，所得的款冬花磷酸酯多糖的取代度分別是0.695，0.698，0.699，平均取代度為：0.697，所得結果與預測值十分接近，說明了響應面預測所得模型的正確性。2.3款冬花磷酸酯多糖的表征為確認是否得到目標產物，本研究選擇款冬花多糖（TFP）和款冬花磷酸酯多糖（TFPP）進行了紅外光譜測定，結果如圖7所示。圖7樣品的紅外光譜圖Fig 7 The IR spectra of sample由圖7可看出，未經修飾的款冬花多糖，在3386cm-1出現了一個寬峰，這是OH的伸縮振動，說明多糖存在分子間與分子內氫鍵；2928cm-1的吸收峰是多糖分子

31、中C-H鍵伸縮振動引起的；1655 cm-1的吸收峰是CO所引起的非對稱伸縮振動峰；在12001400 cm-1出現的一組吸收峰是CH引起的變角振動；在10001200cm-1間出現的吸收峰是CO伸縮振動所引起的；907 cm-1出現的較大的吸收峰是由呋喃環(huán)的對稱伸縮振動所引起的，848 cm-1出現的小峰是次甲基的橫向振動引起的；經過磷酸酯化的款冬花多糖，與修飾前比較，2927cm-1處的CH鍵吸收峰、1664cm-1處的CO吸收峰、12001400 cm-1出現的一組CH吸收峰、在10001200cm-1間出現的CO吸收峰以及907 cm-1呋喃環(huán)吸收峰并沒有發(fā)生明顯變化，這說明修飾對于多

32、糖本身結構的影響不大，基本保持了多糖的原有性質；修飾后的多糖也出現了一些新的變化，其中OH峰的吸收值變小，且分裂成3447和3526cm-1兩個吸收峰，說明多糖中部分OH參與了磷酸酯化反應；13371268cm-1處是PO鍵伸縮振動峰，1020 cm-1處是POC鍵伸縮振動峰；此圖的特征峰同已有磷酸酯多糖譜圖相比，基本相符合11，13，說明得到的產品確定為款冬花磷酸酯多糖。2.4款冬花磷酸酯多糖的抗氧化活性2.4.1 清除DPPH實驗DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，當加入自由基清除劑后，DPPH的單電子就會配對，使其溶液顏色由紫色變淺，因此可用于評價自由基清除劑清除自由基的能力，以抗壞血酸Vc做參

33、照試劑進行清除DPPH的測試，結果如圖8所示。圖8不同質量濃度的樣品對清除DPPH的影響Fig.8 Rate of scavenging DPPH of sample從圖8可以看出，款冬花多糖和款冬花磷酸酯多糖均有一定的清除DPPH能力，隨著多糖濃度的增加，清除能力也在逐漸增大。相比較而言，款冬花磷酸酯多糖的清除能力較好，當質量濃度為6g/L時，其清除率最高為98.91%，幾乎與對照品（Vc）的清除能力相當。這說明用磷酸酯化的方法來修飾款冬花多糖改善了其抗氧化活性。2.4.2 清除超氧陰離子實驗超氧陰離子（O2-）的毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因，它能夠造成膜損傷、線粒體氧化磷酸化作用的改變及

34、其他一系列的變化。通過鄰苯三酚在堿性條件下自氧化生成帶色的中間產物O2-，當釋放出的O2-受到抑制或清除時，就可以阻止中間產物的積累。因此，通過測定樣品對鄰苯三酚自氧化抑制作用，即可表征其對超氧陰離子清除作用。以抗壞血酸VC做參照試劑進行清除O2-的測試，結果見圖9。圖9不同質量濃度的樣品對清除O2-的影響Fig.9 Rate of scavengingO2-of sample從圖9可以看出，款冬花多糖和款冬花磷酸酯多糖清除O2-的能力較弱，隨著多糖濃度的增加，清除能力也在逐漸增大。相比較而言，款冬花磷酸酯多糖的清除能力較好，當質量濃度為6g/L時，其清除率最高為48.85%。這說明用磷酸酯化

35、的方法來修飾款冬花多糖改善了其抗氧化活性。2.4.3 清除羥自由基實驗羥自由基（OH）是最活潑的自由基，它可和活細胞中的任何分子發(fā)生反應而造成損傷，而且反應速度極快，被破壞的分子遍及氨基酸、磷脂、核苷和有機酸等。通過測定樣品對Fenton反應產生羥自由基的清除作用，即可表征其對羥自由基的清除作用。以抗壞血酸VC做參照試劑進行清除OH的測試，結果見圖10。圖10不同質量濃度的樣品對清除OH的影響Fig.10Rate of scavengingOHof sample從圖10可以看出，款冬花多糖和款冬花磷酸酯多糖清除OH的能力較弱，隨著多糖濃度的增加，清除能力也在逐漸增大。相比較而言，款冬花磷酸酯多

36、糖的清除能力較好，當質量濃度為5g/L時，其清除率最高為50.34%。這說明用磷酸酯化的方法來修飾款冬花多糖改善了其抗氧化活性。3 結論本研究針對款冬花磷酸酯多糖的合成工藝路線進行了研究，在單因素實驗基礎上，利用響應面實驗分析方法對其合成工藝條件進行了優(yōu)化，最終確定的工藝條件為：反應時間6.0h，反應溫度86，尿素用量為反應物總質量的14.25%，m（磷酸二氫鈉）:m（磷酸氫二鈉）=2：1，m（混合磷酸鹽）:m（款冬花多糖）=1.5:1。按此工藝條件，所得的款冬花磷酸酯多糖的平均取代度為：0.697，以款冬花多糖計，款冬花磷酸酯多糖得率為31.53%。本法操作條件相對溫和，但反應時間較長，在今

37、后的研究中，將進一步探討通過微波或超聲輔助的方式來提高反應效率。根據款冬花磷酸酯多糖抗氧化性實驗可以看出，磷酸酯化修飾款冬花多糖有利于提升其抗氧化能力。本研究結果可為款冬花多糖的深入研究及同類研究提供一定的理論參考。參考文獻：1 Lin Jun(林俊), Li Ping(李萍), Chen Kaoshan(陳靠山).Advance in studies on anti-tumor activity of polysaccharides in latest five yearsJ.China Journal of Chinese MateriaMedica (中國中藥雜志), 2013, 38(

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