游離鋅離子形態(tài)學(xué)檢測方法探究

1、游離鋅離子形態(tài)學(xué)檢測方法探究【摘要】目的:使用ivZnSAG、ZnSeAG、iZnSAG、TSQ熒光、Zinquin熒光對海馬苔蘚游離鋅離子進(jìn)展染色和比擬。方法:ivZnSAG：采用Na2S溶液灌流的鋅離子結(jié)合方式；ZnSeAG：采用事先注射硒酸鈉的體內(nèi)鋅離子結(jié)合方式；iZnSAG：采用取動物新穎組織浸泡在浸染液中的鋅離子結(jié)合方式；以上三種方法處理后均采用一樣的AG孵育顯色。TSQ、Zinquin熒光:均為新穎組織取材，液氮處理后熒光下觀察。結(jié)果：在小鼠海馬，所有染色方法均能標(biāo)記出苔蘚纖維的染色，各種染色在苔蘚纖維標(biāo)記有細(xì)節(jié)上的差異。所有染色方法中特異性最高的是ZnSeAG；但其敏感性相對較差

2、。而ivZnSAG的敏感性最高，而其特異性那么相對較差。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中使用的游離鋅離子染色方法都能成功的對游離鋅離子進(jìn)展標(biāo)記，而這些染色方法的特異性和敏感性各有不同，對染色細(xì)節(jié)的雕琢才能也各有不同，因此可以根據(jù)這些方法的各自特點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)選取合適的方法。bjetive:TparethedifferenedyingresultsfthefreezininthehippapusssyfiberbeteenthedifferentethdssuhasNa2SAG、ZnSeAG、iZnSAG、TSQflureseneandZinquinfluresene.ethd:Na2SAG：zinasbinedith

3、sdiusulphideperfusin;ZnSeAG：zinasbinedithinjetinsdiuseleniteinadvaned；iZnSAG：theanialsfreshtissueiersedintheTisiersinfluid.AbvedthreeethdsereflledbythesaeAGethd.TSQ、Zinquinfluresene:theanialsfreshtissueserebservedundertheflureseneirspeafterthefrzenintheliquidnitrgen.Results:Inthehippapusftheie,thess

4、yfiberuldbestainedbyallftheabvedethds.Heverthereeresedifferenesbeteentheindetails.Angallftheethdsentinedabve,theZnSeAGethdhadthestspeifiityandthelestsensibilitybuttheivZnSAGethdnthentraryprperly.nlusin:Allftheabveethdsuldaththezin,butthespeifiityandsensibilityaredifferentrespetively.Therefrethesedif

5、ferentethdsareusedinthedifferentexperientsiththedifferentdestinatin.材料與方法1.2主要試劑和藥品TSQ熒光染色試劑(Invitrgen);Zinquin熒光染色試劑(日本，Djindabratries);乳化銀(Fluka);戊巴比妥鈉(Siga);恒冷箱切片機(jī)(LEia);雙目光學(xué)顯微鏡(lypus)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1AG浸染法(iZnSAG)實(shí)驗(yàn)動物2只，均用氯化鈉肝素溶液9l0.9%氯化鈉+1l肝素500IU/l灌流30s，直接用250l3%的戊二醛固定液灌流15in。所有的溶液均用0.5的索倫森磷酸鹽溶液緩沖

6、。迅速取腦組織，并將組織放在快速組織切片機(jī)上，切出12厚的切片，將切片浸入改進(jìn)Ti溶液中，即浸入含0.1%硫化鈉和3%戊二醛的0.1的索倫森磷酸鹽緩沖液中，pH為7.4。將染缸置于震蕩器上，保持4。72h后，將切片用0.1的磷酸鹽緩沖液小心沖洗10in。用于光鏡的：將切片放入30%蔗糖溶液中，直至切片沉到玻璃杯底部。將切片用2冷凍后快速置于冰凍切片機(jī)上，降溫至-17，切10切片，然后切片置于AG孵育液1內(nèi)并在恒溫(26)振動水浴箱內(nèi)孵育60in，常規(guī)脫水透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.2硒酸鈉注射AG法ZnSeAG)實(shí)驗(yàn)動物2只，首先動物預(yù)先注射0.1%硒酸鈉30g/kg，待

7、動物奄奄一息瀕死時(shí)腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，用蠕動泵經(jīng)左心室灌注生理鹽水及2.5%戊二醛灌流，迅速取腦，然后將腦組織放入2.5%戊二醛固定液中后固定46h，然后置于30%蔗糖溶液中，直至組織塊沉到玻璃杯底部。常規(guī)10冰凍切片機(jī)切片，然后切片置于AG孵育液1內(nèi)并在恒溫(26)振動水浴箱內(nèi)孵育60in，常規(guī)脫水透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.3硫化鈉灌流AG法(ivZnSAG)實(shí)驗(yàn)動物2只，頸椎離斷后，首先灌注0.3硫化鈉溶液10in大約150l，然后灌注生理鹽水10in大約150l，最后灌注2.5戊二醛10in大約150l。迅速取大腦組織、2.5戊二醛后固定3h。然

8、后標(biāo)本置于30%蔗糖液4冰箱保存過夜。次日，標(biāo)本用恒冷切片機(jī)制備10的冰凍切片，切片置于AG孵育液1內(nèi)并在恒溫(26)振動水浴箱內(nèi)孵育60in，常規(guī)脫水透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.4Zinquin熒光染色實(shí)驗(yàn)動物2只，過量麻藥處死，迅速取腦，放入液氮中，10in后，將腦組織放入冰凍切片機(jī)中，冰凍切片20，空氣中晾干。冷丙酮固定10in，Zinquin熒光溶液150孵育2h避光，0.1PBS沖洗3次各10in避光。熒光顯微鏡觀察，360n紫外光激發(fā)。1.3.5TSQ熒光染色實(shí)驗(yàn)動物2只，過量麻藥處死，迅速取出大腦，放入液氮中，10in后，將腦組織置于冰凍切片機(jī)中，冰凍切片2

9、0，空氣中晾干。避光條件下，切片浸入4.5TSQ溶液中孵育6090s，然后用0.9%生理鹽水沖洗60s。熒光顯微鏡觀察，360n紫外光激發(fā)。2結(jié)果圖1小鼠海馬三種AG反響陽性顆粒的分布403討論機(jī)體內(nèi)游離鋅離子的染色方法眾多，主要有各種AG染色方法以及各種鋅離子染色熒光。對于各種鋅離子染色的特點(diǎn)缺乏專門的文獻(xiàn)進(jìn)展報(bào)道，因此使實(shí)驗(yàn)方法的選擇成了一個(gè)難題。本實(shí)驗(yàn)使用5種比擬常規(guī)的機(jī)體內(nèi)游離鋅離子追蹤的染色方法，對其染色特點(diǎn)進(jìn)展了比對。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)ZnSeAG染色法對游離鋅離子的特異性很高，但其染色強(qiáng)度稍差，因此非常適用于一些含鋅較多的區(qū)域來表達(dá)游離鋅離子染色的細(xì)節(jié)，譬如對小鼠癲癇后海馬苔

10、蘚纖維出芽FS進(jìn)展染色。此前，我們曾使用此方法對匹羅卡品小鼠癲癇模型的海馬的FS進(jìn)展了染色，獲得了較好的效果。ivZnSAG染色法對游離鋅離子的敏感性非常高，其染色強(qiáng)度是3種AG染色中最高的，但非特異性反響稍多，此種方法比擬適用于含鋅量較少的組織部位；而且由于其采用了組織灌流Na2S的鋅離子結(jié)合方式，所以對組織內(nèi)游離鋅離子的結(jié)合存在著即時(shí)性，非常合適捕捉機(jī)體某種生理狀態(tài)或病理態(tài)下鋅離子的分布狀態(tài)。iZnSAG在3種AG染色方法中特異性和敏感性居中，顯得特點(diǎn)缺乏，但是此種方法可以使一些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞著色，這個(gè)染色特點(diǎn)也答應(yīng)以做為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色方法方面的一個(gè)開展方向。另外，浸染法的鋅離子結(jié)合是新穎組織浸泡于浸染液中，因此其標(biāo)本中染色差異是3種AG方法中最低的，根本不受動物的個(gè)體差異影響，非常合適做鋅離子濃度在不同動物之間的比對。本實(shí)驗(yàn)還采用了TSQ、Zinquin兩種熒光染色法對海馬苔蘚纖維進(jìn)展了染色。兩種熒光染色均能標(biāo)記出苔蘚纖維，但其熒光染色與AG類染色方法相比，染色彌散且缺乏對細(xì)節(jié)的渲染才能。因此這兩種熒光染色法適用于對染色細(xì)節(jié)要求不高而對染色敏感性要求較高的實(shí)驗(yàn)，譬如一些體外培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。另外，兩種熒光染色可以與其他物質(zhì)進(jìn)展熒光下的雙重標(biāo)記甚至三重標(biāo)記，可以檢測出體內(nèi)游離鋅離子與其他的檢測物質(zhì)之間的互相分布情況，這個(gè)優(yōu)勢是3種AG方法所不具備的。在三種AG染色法中