高效液相色譜法

1、高效液相色譜法1簡述高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵人裝有填充劑的色譜柱，對供試品進展別離側(cè)定的色譜方法。注人的供試品，由流動相帶入柱，各組分在柱被別離，并依次進人檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。對儀器的一般要求所用的儀器為高效液相色譜儀，由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，儀器應按現(xiàn)行國家技術(shù)監(jiān)視局“液相色譜儀檢定規(guī)程定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。色譜柱徑一般為3.94.6叩，填充劑粒徑為310叩。超高效液相色譜儀是適應小粒徑約2叩填充劑的耐超高壓、小進樣量、低死體積、高靈敏度的高效液相色譜儀。色譜柱反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑

2、填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物符合硅膠和聚合物等；常見的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性別離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、外表積、鍵合基團的外表覆蓋度、載體外表基團殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應根據(jù)被別離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇適

3、宜的色譜柱。溫度會影響別離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應注意室溫變化的影響。為改善別離效果可適當提高色譜柱的溫度，但一般不宜超過60。最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氛基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑;分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑;對映異構(gòu)體的別離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、外表積、鍵合基團的外表覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色

4、譜柱的填充，直接影響供試品的保存行為和別離效果?？讖皆?5nm（lnm=10?）以下的填料適于分析分子量小于2000。的化合物，分子量大于2000的化合物那么應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，分析柱的填充劑粒徑一般在310小侖間。粒徑更小約2小仙的填充劑常用于填裝微徑柱徑約2mm）。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配;如有必要，色譜條件也需作適當?shù)恼{(diào)整。當對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應以品種正文規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準。40，為改善別離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60。流動相的pH值應控制在2-8之間.當pH值大于8時，可使載

5、體硅膠溶解;當pH值小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高外表覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機一無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等;當需使用pH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑，或有機一無機雜化填充劑等。檢測器最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電

6、化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的量有關(guān)，還與化合物的構(gòu)造有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應，構(gòu)造相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測器的響應值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定圍呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應值與待測溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進展計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外-可見分光檢測器，所用流動相應符合紫外一可見分光光度法（?中國藥典?2015年版四部通那么0401）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機

7、相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動相。流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相常用甲醇一水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統(tǒng)。流動相中應盡可能不用緩沖鹽，如需用時應盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般不低于5%，否那么易導致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動相常用兩種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。各品種項下規(guī)定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱徑、長度、填充劑粒徑、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進

8、樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品并到達系統(tǒng)適用性試驗的要求。其中，調(diào)整流動相組分比例時，當小比例組分的百分比例X小于等于33%寸，允許改變圍為0.7X1.3X;當X大于33%時，允許改變圍為X-10%X+10%。假設(shè)需要用小粒徑約2叩填充劑，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應作適當?shù)恼{(diào)整。當對其結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準。對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足別離要求的品種，可在該品種正文項下注明。系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、別離度、靈敏度、重復性和拖尾因子等五個參數(shù)。按各

9、品種項下要求對色譜系統(tǒng)進展適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進展試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進展適當調(diào)整，應符合要求。色譜柱的理論板數(shù)(n)用于評價色譜柱的效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或標物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或標物質(zhì)峰的保存時間tR和峰寬(W)或半頂峰寬(Wh/2),按n=16(tRW)2或n=5.54(tRWh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。tR、W、Wh/2可用時間或長度計下同，但應取一

10、樣單位。別離度(R)用于評價待側(cè)組分與相鄰共存物或難別離物質(zhì)之間的別離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標.可以通過測定待測物質(zhì)與雜質(zhì)的別離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分標物質(zhì)或其他難別離物質(zhì)的別離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當?shù)姆椒ń到?，通過測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的別離度，對色譜系統(tǒng)進展評價與調(diào)整。無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與標物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他色譜峰與相鄰色譜峰之間有較好的別離度。除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的別離度應大于1.5。別離度的計算公式為R=2(tR2tR1)/(Wl+W2)或R=2(tR2一tR1)/1.70

11、(W1.h/2+W2.h/2)式中，tR2為相鄰兩峰中后一峰的保存時間；tRl為相鄰兩峰中前一峰的保存時問；W1、W2及Wl.h/2、W2.h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半頂峰寬。當對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n并口別離度（R）均以峰寬（W）的計算結(jié)果為準。重復性用于評價連續(xù)進樣后，色譜系統(tǒng)響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%;采用標法時，通常配制相當于80%.100%?口120%的對照品溶液，參加規(guī)定量的標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差

12、應不大于2.0%=拖尾因子T用于評價色譜峰的對稱性。拖尾因子計算公式為：T=W0.05h/2di式中，W0.05h為5%W高處的峰寬；di為峰頂在5%W高處橫坐標平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的距離。以峰高作定量參數(shù)時，除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應在0.951.05之問。以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性，此時應在各品種正文項下對拖尾因子作出規(guī)定。靈敏度用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比（S/N）來表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定作業(yè)指導書指導書編號T

13、YFDC-SOP-FF-028圖效液相色譜法第5頁共10頁第二版批準忠華初審吳雅凝起草郭欣時，信噪比應不小于10;定性測定時，信噪比應不小于3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設(shè)置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。1.3測定法標法按各品種項下的規(guī)定，精細稱量取對照品和標物質(zhì)，分別配成溶液，精細量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進樣，記錄色譜圖。測量對照品和標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子校正因子（f）=（As/Cs）/（Ar/Cr）式中As為標物質(zhì)的峰面積或峰高；Ar為對照品的峰面積或峰高；Cs為標物質(zhì)的濃度；CR為對照品的濃度。再取各品種項下含有標物質(zhì)的供試品溶液，進樣

14、，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量含量（cx）=f.Ax/（As/cs）式中，Ax為供試品峰面積或峰高；cx為供試品的濃度；A為標物質(zhì)的峰面積或峰高；c為標物質(zhì)的濃度；f為標法校正因子。采用標法，可防止因樣品前處理或進樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。外標法按各品種項下的規(guī)定，精細稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精細取一定量，進樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積或峰高），按下式計算含量含量(Cx)=CR(Ax/Ar)式中各符號意義同上。由于微量注射器不易準確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以手動進樣器定量

15、環(huán)或自動進樣器進樣為宜。加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精細稱(量)取待測物對照品和參比物質(zhì)對照品各適量，配作業(yè)指導書指導書編號TYFDC-SOP-FF-028圖效液相色譜法第6頁共10頁第二版批準忠華初審吳雅凝起草郭欣制待測物校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按下式計算待測物的校正因子。校正因子=(Ca/Aa)/(Cb/Ab)式中CA為待測物的濃度；Aa為待測物的峰面積或峰高；CB為參比物質(zhì)的濃度;；Ab為參比物質(zhì)的峰面積或峰高。也可精細稱量取主成分對照品和雜質(zhì)對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進樣，記錄

16、色譜圖，繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計算校正因子。校正因子可直接載人各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比，采用相對保存時間定位，其數(shù)值一并載人各品種項下。測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當?shù)娜芤?，作為對照溶液，進樣，記錄色譜圖，必要時，調(diào)節(jié)縱坐標圍以噪聲水平可承受為限使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%-25%除另有規(guī)定外，通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%;含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應小于5

17、%;含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分色譜峰保存時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比擬，計算各雜質(zhì)含量。不加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，假設(shè)無法獲得待測雜質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述1.3.3法配制對照溶液、進樣調(diào)節(jié)縱坐標圍和計算峰面積的相對標準偏差后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間應為主成分色譜峰保存時間的2

18、倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比擬，依法計算雜質(zhì)含量。作業(yè)指導書指導書編號TYFDC-SOP-FF-028圖效液相色譜法第7頁共10頁第二版批準忠華初審吳雅凝起草郭欣面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量進樣，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時，由于儀器響應的線性限制，峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。4考前須知流動相的制備與保存用高純度的試劑配制流動相.必要時照紫外一可見分光光度法進展溶劑檢查，應符合要求;水應為新鮮制備的高純水，可用超純水器制得或用重蒸餾

19、水。凡規(guī)定pH值的流動相，應使用精細pH計進展調(diào)節(jié)、除另有規(guī)定外，偏差一般不超過土0.2pH單位。配制好的流動相應通過適宜的0.45或0.22叱H濾膜濾過，以除去雜質(zhì)微粒。流動相用前必須脫氣，否那么容易在系統(tǒng)逸出氣泡，影響泵的工作、色譜柱的別離效率、檢測器的靈敏度以及基線穩(wěn)定性等。流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯等容器，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙睛等可浸出塑料外表的增塑劑，導致流動相受污染。貯存容器一定要蓋嚴，以防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶人流動相引起pH值變化，對別離或分析結(jié)果帶來誤差。磷酸鹽、醋酸鹽緩沖液容易發(fā)霉變質(zhì)，應盡量新鮮配制使用。如確需貯存，可

20、在冰箱冷藏，并在3天使用，用前應重新濾過。溶液的配制與保存除另有規(guī)定外，采用規(guī)定溶劑配制對照品溶液和供試品溶液，定量測定時，對照品溶液和供試品溶液均應分別配制兩份。供試品溶液在注人液相色譜儀前，一般應經(jīng)適宜的0.45m或22仙M濾膜濾過，以減少對色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或影響色譜別離。應根據(jù)試驗要求和供試品的穩(wěn)定性，設(shè)置待測溶液的貯存條件如溫度、遮光等。色譜柱的使用.與保存根據(jù)實驗要求和流動相的pH值圍，參照色譜柱說明書，選用適宜的色譜柱。安裝色譜柱時應使流動相流路的方向與色譜柱標簽上箭頭所示方向一致。除另有規(guī)定外，不宜反向使用，否那么會導致色譜柱柱效明顯作業(yè)指導書指導書編號TYFDC-SOP-FF-

21、028圖效液相色譜法第8頁共10頁第二版批準忠華初審吳雅凝起草郭欣降低，無法恢復。進樣前，色譜柱應用流動相充分沖洗平衡。經(jīng)色譜系統(tǒng)適用性試驗測試，應符合要求。色譜柱在使用過程中，應防止壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者機械震動都會影響柱固定相的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱填料，因此在調(diào)節(jié)流動相流速時應該緩慢進展。試驗完畢后，可按色譜柱的使用說明書，對色譜柱進展沖洗和保存。一般來講，對于反相色譜柱，如使用緩沖液或含鹽溶液作為流動相，在試驗完畢后，應用10倍柱體積0如150mm柱長，約15mL的低濃度的甲醇/乙睛一水溶液10%-20%沖洗，使色譜柱的鹽完全溶解洗脫出

22、，再用較高濃度的甲醇/乙睛一水溶液50%沖洗，最后用高濃度的甲醇/乙臘一水溶液80%-100%沖洗，使色譜柱中的強吸附物質(zhì)沖洗出來。如色譜柱需長期保存，反相柱可以貯存于甲醇或乙睛中，正相柱可以貯存于經(jīng)脫水處理后的正己烷中，離子交換柱可以貯存于含5%甲醇或含0.05疊氮化鈉的水中，并將色譜柱的兩端密封。以免于燥，室溫保存。流動相的調(diào)整為滿足色譜系統(tǒng)適用性要求，試驗中有時需要調(diào)整流動相組分的比例。在調(diào)整流動相組分比例時，當小比例組分的百分比例X小于等于33%時，允許改變圍為0.7X1.3X;當X大于33%時，允許改變圍為X-10%X+10%。下面舉例說明。二元流動相系統(tǒng)。例1兩組分比例為50:50

23、按上述原那么，X=50%,33%該流動相比例調(diào)節(jié)的圍是X-10%X+10%,即40:60至60。0例2兩組分比例為2:98,X=2%,33%按上述原那么，2%的允許改變圍為0.7X1.3X,即1.42.6故該流動相比例調(diào)節(jié)的圍是1.4:98.6至2.6:97.4。三元流動相系統(tǒng)例3三組分比例為60:35:5按上述原那么，可每次調(diào)節(jié)流動相系統(tǒng)中比例較低的兩個組分。對35%的組分，其流動相比例調(diào)節(jié)的圍是X-10%X+10%,即25%-45%那么流動相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)圍是50:45:5至70:25:5作業(yè)指導書指導書編號TYFDC-SOP-FF-028圖效液相色譜法第9頁共10頁第二版批準忠華初審吳雅

24、凝起草郭欣對于5%的組分，其允許改變圍為0.7X1.3X,即3.5%6.5%,那么流動相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)圍是58.5:35:6.笄61.5:35:3.5雜質(zhì)檢查時色譜參數(shù)的設(shè)置在進展雜質(zhì)檢查時，選擇適宜的檢測靈敏度和設(shè)定適宜的積分參數(shù)非常重要。國藥品質(zhì)量標準中，通常制備與雜質(zhì)限度相當濃度的對照溶液，用以調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使對照溶液的主成分色譜峰的峰高達湖量程的10%5%,再進展供試品溶液的測定，以峰面積計算單個雜質(zhì)量和總雜質(zhì)量。目前國色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)大致有積分儀和色譜工作站兩種類型，對于傳統(tǒng)的積分儀，由于記錄儀的滿量程是固定的，因此檢測靈敏度的調(diào)節(jié)通常是調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度使色譜峰高到達記錄儀滿量程的某個圍；而對于色譜工作站，由于記錄標尺的滿刻度是可調(diào)的，所以通常是調(diào)節(jié)滿刻度的設(shè)定值，使色譜峰的量程占滿刻度的某個圍。無論使用的是積分儀，或者是色譜工作站，如質(zhì)量標準中沒有明確規(guī)定峰面積的取舍限值，或沒有設(shè)定靈敏度測試溶液，那么在實際檢驗中，實驗者通常根據(jù)以往經(jīng)歷設(shè)定積分參數(shù)和小峰面積，