流式細(xì)胞術(shù)鑒定超微量免疫細(xì)胞樣本

1、使用CD115來(lái)鑒定和分析小鼠血中單核細(xì)胞12月2日1血中的單核細(xì)胞白血球細(xì)胞 (leucocyte)：粒細(xì)胞和非粒細(xì)胞粒細(xì)胞（多形核白細(xì)胞）: 中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞 非粒細(xì)胞 （單核白細(xì)胞）：淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞背景介紹GKoenderman L et al. J Leukoc Biol 2000;68:58-642背景介紹縱向小鼠模型（非致死）: 重要性：可用于預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加，縱向評(píng)估病情的進(jìn)展 需求：觀察小鼠模型個(gè)體在外界刺激或者藥物反應(yīng)中的長(zhǎng)期變化 困難：每次可采集的小鼠血液樣本體積非常小小鼠單核細(xì)胞標(biāo)記(占血液中細(xì)胞總數(shù)3%)CD11b: 表達(dá)在多種細(xì)胞

2、表面 （髓樣細(xì)胞，NK細(xì)胞， 活化的T細(xì)胞，B細(xì)胞 ）CD14: 表面表達(dá)量低或檢測(cè)不到常用3-由此,需要建立有效的實(shí)驗(yàn)方案建立小鼠縱向模型，需要一種流式細(xì)胞儀， 可檢測(cè)超微量血液樣品 同時(shí)又需保證重復(fù)性，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確更加可行的單核細(xì)胞標(biāo)記，用于FACS:CD115- 細(xì)胞表面標(biāo)記本身具有穩(wěn)定性, 在檢測(cè)微量血液樣品體積時(shí)，測(cè)試結(jié)果具有一致性提出的問(wèn)題及實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)VS4小鼠血樣的采集 CD-1 雄性小鼠,大隱靜脈取血（每次采樣0.5%體重，非致死方式）材料與方法實(shí)驗(yàn) 1: 比較常用的小鼠單核細(xì)胞表面標(biāo)記 (Guava easyCyte Mini)實(shí)驗(yàn) 2: 鑒定不同單核細(xì)胞表面標(biāo)記的穩(wěn)定性A: 維

3、持的時(shí)間長(zhǎng)度B: 不同的激光強(qiáng)度(Guava EasyCyte Mini20mW; Guava easyCyte 6HT-2L40mW)C: 不同的抗凝劑實(shí)驗(yàn) 3: 確定可用于檢測(cè)的最小血樣體積(40ul、20ul、10ul、5ul)5結(jié)果 1比較小鼠單核細(xì)胞的表面標(biāo)記 （CD115 vs CD11b，CD14）95% CD115陽(yáng)性細(xì)胞: 共表達(dá)CD11b+85% CD115陽(yáng)性細(xì)胞: 共表達(dá)CD14+ 如以CD115選取細(xì)胞群CD11b及CD14陽(yáng)性率 差異小650% CD11b陽(yáng)性細(xì)胞:共表達(dá) CD11570% CD14陽(yáng)性細(xì)胞: 共表達(dá) CD115如以CD14與CD11b選取細(xì)胞群CD

4、115陽(yáng)性率 差異大結(jié)果 1比較小鼠單核細(xì)胞的表面標(biāo)記 （CD11b，CD14 vs CD115）795% CD115+: CD11b+85% CD115+: CD14使用CD115+ 設(shè)門(mén)選取細(xì)胞群觀察 CD11b與CD14CD115所選取的細(xì)胞群亦表現(xiàn)在CD11b及CD14陽(yáng)性區(qū)域結(jié)果 1比較小鼠單核細(xì)胞的表面標(biāo)記 （CD115 與 CD11b，CD14）8鑒定單核細(xì)胞表面標(biāo)記CD115的穩(wěn)定性-A:維持的時(shí)間長(zhǎng)度 0hr 2hr 4hrCD115:33% 降低CD11b:6.5% 降低結(jié)果 29easyCyte Mini: 20mWeasyCyte 6HT-2L:40mW更強(qiáng)的激光強(qiáng)度，

5、更高的 gMFI但信號(hào)的降低程度一致 (33%)結(jié)果 2鑒定單核細(xì)胞表面標(biāo)記CD115的穩(wěn)定性-B:不同的激光強(qiáng)度10EDTA 4-8度（RT）更加穩(wěn)定結(jié)果 2鑒定單核細(xì)胞表面標(biāo)記CD115的穩(wěn)定性-B:不同的抗凝劑11確定可用于檢測(cè)的最小血樣體積單核細(xì)胞總量: CD115+經(jīng)典單核細(xì)胞: CD115+ Gr-1high 非經(jīng)典單核細(xì)胞: CD115+ Gr-1low800060003500200040,20,10ul:差異性 10% 5ul:每次取樣，單核細(xì)胞分亞型檢測(cè)時(shí)差異大因此,10ul 不推薦！用于分析單核細(xì)胞的亞型結(jié)果 312結(jié)論細(xì)胞表面標(biāo)記：選擇CD115抗體鑒定本身雖具有不穩(wěn)定性，但相比傳統(tǒng)的表面標(biāo)記選取單核細(xì)胞群更加準(zhǔn)確(時(shí)間控制, EDTA+冰上, 強(qiáng)的激光強(qiáng)度) 實(shí)驗(yàn)對(duì)象：小鼠縱向（非致死）模型確保了非致死取血的可能性據(jù)此建立小鼠模型可檢測(cè)個(gè)體變化(=0.5% 的小鼠體重：可兩周取一次, =0.05% 的小鼠體重：每天取) 檢測(cè)平臺(tái)：高性能超