中山毒理微核試驗(yàn)和染色體畸變課件

1、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)受試物: 環(huán)磷酰胺受試動物: 小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞(PCE)微核測定方法 細(xì)胞分裂分為四個期：1、G1期（DNA合成前期）：細(xì)胞生長，為DNA復(fù)制做 準(zhǔn)備。2、S期（DNA合成期）：體細(xì)胞的DNA含量由2C增加到4C3、G2期(DNA合成后期)：該期主要為M期作準(zhǔn)備，包括復(fù)制因子的失活和有絲分裂促進(jìn)因子的分化,有關(guān)細(xì)胞骨架系統(tǒng)重新組裝的蛋白質(zhì)合成4、M期(有絲分裂期)：前期，早中期，中期， 后期（微核形成期），末期圖13-1 細(xì)胞周期可劃分為四個階段 原理：1 有絲分裂毒物的作用使個別染色體或帶著絲點(diǎn) 的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被滯留在細(xì)胞質(zhì)中2

2、斷片或無著絲點(diǎn)染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動，從而遺留在細(xì)胞質(zhì)中 結(jié)論： 微核試驗(yàn)?zāi)軝z測化學(xué)或其他物質(zhì)因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)操作步驟：一染毒：染毒途徑：腹腔注射環(huán)磷酰胺，染毒二次，0、24小時各染毒一次，6h后取樣染毒劑量：50mg/kg二處死：頸椎脫臼法處死小鼠三：骨髓液的制備和涂片1 處理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去每節(jié)骨骺，用彎止血鉗將骨髓擠于預(yù)先滴有小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片 2 固定：將推好涼干的骨髓片放進(jìn)染色缸，甲醇固定15分鐘，取出晾干 3 染色：用新鮮配制的Giemsa應(yīng)用液（Giemsa儲備液一份加pH6.8的磷酸

3、鹽緩沖液9份）染色1015分鐘，細(xì)流水沖掉玻片染色液，晾干 四觀察和計(jì)數(shù)： 觀察：先用低倍鏡觀察，選擇分布均勻的域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）桔黃色。細(xì)胞中的微核大半呈圓形，邊緣光滑，嗜色性與核質(zhì)一致，一個細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個或多個微核。 計(jì)數(shù)：1000個PCE中含微核的PCE數(shù)，并計(jì)算200個細(xì)胞中PCE/NCE的比值結(jié)果與分析： 1 結(jié)果：試驗(yàn)只計(jì)數(shù)PCE中的微核，微核率以千分率表示。每組的雌雄動物分開計(jì)數(shù)微核PCE均值。2 分析：正常的PCE/NCE比值為1（0.6-1.2），如果0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如果0.05，則表示受試物劑量過大，結(jié)

4、果不可靠。 圖 1 ：正常嗜多染紅細(xì)胞 PCE （ 400 ） 圖 2 帶微核嗜多染紅細(xì)胞 MNPCE （ 400） 注意事項(xiàng)： 1、剪胸骨時通過剪斷兩邊的肋骨來把整塊胸骨取下來，以防不小心把胸骨剪斷 2、擠出骨髓處的肌肉要剔除干凈 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂時要涂勻，以便推片 4、染色前可以先看一下整體涂片情況，細(xì)胞分散度是否良好 5、關(guān)鍵步驟是制作良好的骨髓涂片以及優(yōu)良的染色動物骨髓細(xì)胞染色體畸變分析目的和意義:1、學(xué)習(xí)動物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制作2、了解動物體內(nèi)染毒及染色體畸變類型 實(shí)驗(yàn)原理: 1 染色體畸變只能在細(xì)胞分裂的中期進(jìn)行觀察和分析，為收集足夠的中期相細(xì)胞，在收獲細(xì)胞

5、前，用秋水仙堿處理，以阻斷微管蛋白的聚合，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，使分裂間期和前期的細(xì)胞停留在中期相。 2 細(xì)胞通過低滲，使染色體均勻散開，然后固定、染色，可在油鏡下觀察操作步驟一、收獲細(xì)胞 1 秋水仙堿處理實(shí)驗(yàn)動物（小鼠4mg/kg 處死動物前6h腹腔注射） 2 取股骨 3 PBS液5ml沖洗骨髓，1500r/min離心10min， 去上清二、低滲 1 打散沉淀物，加入37 預(yù)溫的0.075mol/L的 KCl 6ml混勻，于37低滲1520min 2 再加固定液12ml混勻，立即于1000r/min離心10min，去上清 三、固定 1 使細(xì)胞懸浮，加入固定液4ml混勻，放置室溫1020

6、min，然后1000r/min離心10min，去上清 2 同樣方法再固定一次，去上清，留0.5ml 四、制片染色 使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸液滴于冰凍的載玻片上，干燥，用10Giemsa染液染色1020min，取出清洗自然干 五、閱片 先在底倍鏡下選擇分散良好、細(xì)胞未破裂的中期分裂相，油鏡下觀察并記錄染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常細(xì)胞結(jié)果分析與評價結(jié)果： 以每只動物為觀察單位，每只動物觀察100個中期分裂相，計(jì)算其畸變細(xì)胞率分析與評價： 1 陰性和陽性對照組的畸變率應(yīng)與所用動物的種屬及有關(guān)資料相符 2 試驗(yàn)結(jié)果可以用多種統(tǒng)計(jì)方法處理，所得結(jié)果應(yīng)該是相同的 3 各實(shí)驗(yàn)組即便細(xì)胞率與陰性對照組相比較，應(yīng)該有顯著性差異，還應(yīng)有劑量反應(yīng)關(guān)系圖 1：正常精母細(xì)胞（ 1000 ） 圖 2 ：精母細(xì)胞染色體環(huán)（ 100