檢驗主管技師-臨床免疫學和免疫2021全1

1、第一節(jié) 放射免疫技術一、基本類型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素標記抗原與未標記抗原競爭結合特異性抗體，測定樣品中抗原量的一種分析法。（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素標記的過量抗體與待測抗原直接結合，固相免疫吸附載體分離結合與游離標記抗體的非競爭放射免疫分析法。二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C 等，使用最廣泛的是 125I。三、放射性標記物及鑒定（一）原理：以放射性碘原子置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。蛋白質、肽類等含有上述基團，可用 125直接標記，不含上述基團的甾體激素或藥物分子，須連接相應基團才能用于放射性碘標記。（二

2、）標記及類型直接標記法：肽類、蛋白質和酶的碘化標記。常用的方法為：氯胺 T（ch-T）法；乳過氧化物酶標記法。間接標記法：也稱連接標記法，是最常用的間接碘標記方法。該法主用于甾體類化合物、環(huán)核苷酸、素等缺乏碘標記基團的小分子化合物的標記。（三）放射標記物的純化凝膠過濾法：分子篩機制。離子交換層析法：游離 125與標記物分子極性差異進行吸附解離。聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）：按分子所帶電荷和直徑不同在電場作用下分子遷移速率不同。高效液相色譜法。（四）放射標記的鑒定1.放射化學純度：標記物中結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率，要求95%。該參數(shù)還是觀察在期內標記物脫碘程度的重要指標。2

3、.免疫活性：的標記物與抗體結合的能力。3.比放射活性：數(shù)目?；瘜W量標記物中所含的放射性強度，即每分子被標記物平均所結合放射性原子四、方法學評價除常規(guī)的靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩(wěn)定性等指標外，還應注意以下指標：（一）可靠性：又稱健全性，是評價被測物與標準品的免疫活性是否相同。借助標準曲線與樣品稀釋曲線的平行性分析來判斷。平行性好者可靠。（二）劑量-反應曲線：通過已知濃度的標準品和相應的反應參數(shù)繪制成劑量-反應曲線，待測物定量是通過計算其反應參數(shù)在劑量-反應曲線上對應的標準品濃度值而確定。（三）高劑量鉤狀效應：標本中被測物濃度超過線性范圍上限時，所得結果反而降低或呈象?？梢酝ㄟ^選用髙親和力

4、抗體或對此類標本進行稀釋后測定以改善或消除。的現(xiàn)第二節(jié) 放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是以放射性核素作示蹤劑的標記免疫分析方法，特別適用于激素、多肽等的超微量分析。一、基本原理經典 RIA 是采用標記抗原和非標記抗原競爭性結合有限量特異性抗體的反應。二、實驗方法及測定（一）抗原抗體反應：將未標記抗原（標準品和待測樣品）、標記抗原和特異性抗體加入反應試管中，在一定條件（溫度、時間及介質 pH）下進行競爭抑制反應。先加待測樣品（或標準品）和抗爭與抗體結合。，使非標記抗原與抗體達到結合平衡，然后再加入標記抗原競（二）分離結合與游離標記物：RIA 反應平衡后，標記抗原與試劑抗體形成免疫復合物（B）

5、。由于其含量極少，不能自行沉淀，需加入適當?shù)某恋韯⑵鋸氐壮恋?，然后經離心使其與游離的標記抗原分離。某些小分子抗原，也可采用吸附法分離B 與 F。分離方法包括：第二抗體沉淀法：反應完成后加入二抗形成復合沉淀。為增強效果可加入一定量的與一抗同種動物的或 IgG，或是將二抗與某些顆粒固相物連接。2.聚乙二醇（PEG）沉淀法：能非特異地沉淀抗原抗體復合物等大分子蛋白質，而不沉淀小分子抗原。當溫度髙于 30時，沉淀物易復溶。3.PR 試劑法：先將二抗與 PEG 按一定比例混了二者的用量，且分離迅速，簡便。懸液后進行試驗。此法保留了二者的優(yōu)點，節(jié)省4.活性炭吸附法：活性炭可吸附小分子游離抗原或半抗原，而

6、大分子蛋白（如抗體和免疫復合物）則留在溶液中。（三）放射性測量及數(shù)據(jù)處理分離 B（免疫復合物）、F（游離標記抗原）后，可分別對二者進定。繪制標準曲線（劑量-反應曲線），樣品管以其測量或計算的反應參數(shù)，通過標準曲線即可查出相應的待檢抗原濃度。第三節(jié) 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是以過量 125I 標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結合反應，用固相免疫吸附劑對 B 或 F 進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于 RIA，操作程序較 RIA 簡單。一、基本原理1.點 IRMA：利用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原-抗體復合物，反應平衡后，再用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標記抗體并將其

7、分離，測定上清液的放射量。2.雙位點 IRMA：先用固相抗體與抗原反應結合，然后再用過量的標記抗體與已結合于固相的抗原的另一抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物，洗棄反應液中剩余的標記抗體，測定固相上的放射性。兩種 IRMA 最后測得的放射性均與樣品中待測抗原的含量呈正相關。二、IRMA 與 RIA 的比較RIAIRMA標記物標記抗原（抗原不同，標記物和標記方法不同）標記抗體（方法基本相同）反應速率較慢抗體過量，反應速率稍快反應原理競爭抑制性結合，反應參數(shù)與待檢抗原量成反比非競爭性結合，反應參數(shù)與待檢抗原濃度呈正相關第四節(jié) 放射免疫分析技術的應用常用于各種激素、微量蛋白質、腫瘤標

8、志物和藥物等微量物質的測定。但具有放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，試劑盒有效期不長，無法自動化分析等諸多不足。下列有關放射免疫分析的敘述中，錯誤的是A.以放射性核素作為標記物 B.是一種定量檢測技術C.主要用于抗原檢測D.形成的免疫復合物中的放射強度與待測抗原含量成正比 E.定量分析時需同時作標準管正確D放射免疫分析形成的免疫復合物中的放射強度與待測抗原含量成反比。在放射免疫分析檢測中，B/（B+F）表示（注：B 為結合態(tài)的標記抗原，F(xiàn) 為游離態(tài)的標記抗原）A.結合態(tài)的標記抗原與總的標記抗原之比 B.結合態(tài)的標記抗原與游離的標記抗原之比 C.總標記抗原與抗原抗體復合物之比D.結合態(tài)的抗

9、原與總抗體之比E.結合態(tài)的抗原與總抗原之比正確A在放射免疫分析檢測中，B/（B+F）表示結合態(tài)的標記抗原與總的標記抗原之比。在 RIA 反應系統(tǒng)中，參與反應的有標記抗原、已知抗體和待測抗原，對這三種成分的要求是A.只需固定標記抗原量 B.待測抗原要先標記C.標記抗原和已知抗體的量都是固定量的 D.只需要固定已知抗體的量E.三者的量均需固定正確C在 RIA 反應系統(tǒng)中，參與反應的有標記抗原、已知抗體和待測抗原，其中標記抗原和已知抗體的量都是固定量的。臨通常不利于放射免疫分析技術檢測的是微量蛋白質激素特異性特異性較低雙抗體，反應不易受交叉反應物干擾，特異性較高靈敏度抗原與限量抗體的結合不充分，靈微量抗原可與抗體充分結合，靈敏度高敏度低標準曲線較窄工作范圍寬 12 個數(shù)量級抗體特點多克隆抗體，用量少親和力要求低，用量多用途測定大分子和小分子抗原測定至少有兩個抗原決定簇的抗原C.小分子藥物D.腫瘤標記物 E.免疫球蛋白正確E免疫球蛋白比較大，不用放射免疫分析技術檢測。臨放射免疫分析最常用的放射性核素是A.125I B.131I C.3H D.14CE.51Gr正