5超分辨熒光成像技術(shù)

1、超分辨熒光成像技術(shù) 匯報(bào)組員李喆 徐雪卉 王華英 趙克麗組長 林嬌5超分辨顯微成像技術(shù)定義：遠(yuǎn)場條件下基于熒光的，“突破”衍射極限的光學(xué)顯微成像技術(shù)。1.衍射極限 阿貝光學(xué)衍射極限：可見光波段（400-700nm）,水的折射率為1.33，而sin最大為1，則其分辨率極限為150nm.實(shí)際上NA(數(shù)字孔徑)為約為1.也就是說在兩個點(diǎn)光源相距200nm以內(nèi)時，Airy disk 有很大重疊而無法分開。2.“突破”光學(xué)光學(xué)顯微成像的衍射極限 衍射極限為遠(yuǎn)場效應(yīng)，在近場下無效。 通過應(yīng)用一系列物理原理 、化學(xué)機(jī)制和算法“ 突破”了光學(xué)衍射極限,把光學(xué)顯微鏡的分辨率提高了幾十倍 ，使我們能以前所未有的視

2、角觀察生物微觀世界。 d: 分辨率 ； :光波波長：聚焦光錐的半角n : 介質(zhì)的折射率 分類 1.通過調(diào)制照明光斑縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來實(shí)現(xiàn)超分辨成像；基本思想是：在激發(fā)光斑點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)周圍套上一個環(huán)形點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，以“ 擦 除”激發(fā)光斑的外 圍，從 而使得 激 發(fā)光 斑 “ 變小 ”。 包括受激發(fā)損耗顯微技術(shù)（STEM）;可逆飽和線性熒光躍（RESOLFT)；飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（SSIM） 2.基于單個熒光分子的定位 ；雖然 Abbe 衍射極限指出無法區(qū)分相距約 200nm 的兩個熒光分子 ，但是通過提取單個熒光分子的愛里斑信息卻可以實(shí)現(xiàn)對這個熒光分子 的精確定位 。 包括光激活定位顯微技術(shù)

3、（PALM）;隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（STORM） 1.飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)（SSIM） 2.可逆飽和線性熒光躍遷（RESOLFT） 3.受激發(fā)損耗顯微技術(shù)（STED） 4.隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（STORM） 5.光激活定位顯微技術(shù)（PALM）縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)單個熒光分子定位基于縮小PSF的超分辨成像技術(shù) 第一篇SSIM的特點(diǎn)1.無論是線性還是非線性結(jié)構(gòu)光照明所獲取的顯微圖像都比常規(guī)顯微圖像具有更清晰、更豐富的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)。利用常規(guī)顯微鏡、常規(guī)濾波、線性結(jié)構(gòu)光照明以及采用 2 級諧波的 非線性結(jié)構(gòu)光照明對細(xì)胞微管所成圖像。比例尺500nm2.觀察生物樣品的動態(tài)特性 要觀察生物樣品的動態(tài)特性就要有

4、較高的成像速度，結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡只需要獲得幾幅初始圖像即可重構(gòu)超分辨圖像的特點(diǎn)使其能滿足這種成像速度要求。如3D-SIM分析了不同細(xì)胞周期狀態(tài)下人體細(xì)胞中心體的中心粒與中心粒周圍基質(zhì)之間的空間關(guān)系.3.相比于其他超分辨熒光顯微技術(shù)而言，結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡提升分辨率的能力偏低。超分辨熒光顯微鏡術(shù) 分辨率光激活定位顯微技術(shù)1nm隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)20-30nm受激發(fā)損耗顯微技術(shù)大約50nm飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)徑向 100 nm 、軸向 約200 nm 可逆飽和線性熒光躍遷（RESOLFT） 圖 1 RESOLFT過程的原理圖AB的轉(zhuǎn)移過程可以由入射光來驅(qū)動。而反轉(zhuǎn)移過程 BA 可以由任意形

5、式的能量來驅(qū)動，如光、化學(xué)反應(yīng)、熱能，甚至是自發(fā)輻射等。I 決定熒光分子的狀態(tài)；定義飽和光強(qiáng)（Isat=kBA/BA）,則當(dāng)IIsat時，熒光分子將總處于B狀態(tài)。 原理：可逆光飽和轉(zhuǎn)移過程。轉(zhuǎn)移截面大小 RESOLFT過程的原理圖-2半峰全寬入射光強(qiáng)度 I=I(X) 在 xi 點(diǎn)必須等于0; 實(shí)際中當(dāng)位 于 xi 點(diǎn)的激光光強(qiáng)小于峰值光強(qiáng) Imax 的 1即可。 I(X)作用A狀態(tài)熒光分子群時，ImaxIsat,則除了xi 點(diǎn)及其周圍區(qū)域外，其他區(qū)域熒光分子都傾向轉(zhuǎn)化成B狀態(tài)。受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（STED）原理：通過受激發(fā)射損耗的方式來改變熒光基團(tuán)發(fā)射熒光的區(qū)域，借助受激輻射過程中的非線性效

6、應(yīng)，壓縮 PSF，突破衍射極限對分辨率的限制實(shí)現(xiàn)超分辨成像。受激發(fā)能級圖STED 顯微鏡的結(jié)構(gòu)xy 平面STED顯微鏡壓縮 PSF的示意圖L1L0A. S1最低能級的熒光分子遇到波長與基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級差相匹配的光子就會發(fā)生受激輻射回到基態(tài)，失去發(fā)熒光的能力。B.STED 顯微鏡借助波長相對于激發(fā)光紅移的STED 光來壓縮PSF。C.STED 光產(chǎn)生的圓環(huán)光斑是中心強(qiáng)度為零而中心以外區(qū)域強(qiáng)度不為零的圓環(huán)光斑。受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（STED）-優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時變化的過程。如神經(jīng)元突觸小泡運(yùn)動的實(shí)時成像視頻記錄.應(yīng)用 STED 技術(shù)已經(jīng)可以以視頻的速度(每秒 28 幀)來采

7、集記錄神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)突觸小泡的高分辨率圖像(50 nm)。缺點(diǎn)：1.可能發(fā)生熒光漂白 ,這個過程是不可逆的 ,影響到熒光的發(fā)光效果 ,會削弱系統(tǒng)的分辨率。2.光路復(fù)雜，設(shè)備昂貴，對系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求很高基于單分子成像的超分辨技術(shù)第二篇1.隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（STORM） 隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)即stochastic optical reconstruction microscopy（簡稱STORM），是一種基于單分子成像的超分辨率顯微成像方法。2006年底，美國霍華德-休斯研究所的華裔科學(xué)家莊小威實(shí)驗(yàn)組開發(fā)出來這種類似于PALM的方法，可以用來研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白、DNA等的超分辨率定位。STORM基本

8、原理是利用高精度熒光分子定位技術(shù)和熒光分子開關(guān)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)超分辨成像。關(guān)鍵：熒光染色對 Cy5-Cy3 STORM成像過程激發(fā)態(tài)Cy 5633nm激光532nm激光基態(tài)Cy 5STORM的優(yōu)點(diǎn)1.分辨率高：相較于普通熒光顯微技術(shù)，STORM突破了衍射極限，分辨率大幅提高。2.彩色成像。用不同顏色的熒光分子對標(biāo)記研究對象，選取恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光，就能區(qū)分細(xì)胞內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)，分析結(jié)構(gòu)間的相互作用。哺乳動物細(xì)胞微管（綠色）和被膜小窩（紅色）普通熒光顯微成像與STORM成像效果對比圖。3. 3D成像：借助像散成像技術(shù)獲得觀測對象的Z軸信息，可獲得生物大分子的STORM3D圖像。圖6.哺乳動物細(xì)胞微管普通熒光顯微成像與STORM3D成像效果對比圖。STORM的缺點(diǎn)由于需要反復(fù)激活-猝滅熒光分子，所以使得實(shí)驗(yàn)大多數(shù)在固定的細(xì)胞上完成。即使是在活細(xì)胞上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，也不易獲得足夠高的時間分辨率。 2.光激活定位顯微技術(shù)（PALM） PA-GFP標(biāo)記蛋白 低能量405nm 激光照射細(xì)胞表面 488nm激光照射用 488nm 激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確地?zé)晒夥肿樱蛊涫グl(fā)射熒光能力原理：利用單分子熒光成像，突破光學(xué)顯微鏡的定位精度的一種光敏定位技術(shù)。PALM的缺點(diǎn)PALM的成像方法只能用來觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，而對于分辨細(xì)胞內(nèi)源