waters高效液相色譜

1、Waters高效液相色譜操作說明一. 簡介本高效液相色譜實(shí)驗(yàn)包括：waters1525泵+waters2487雙波長檢測器+色譜柱+電腦（breeze 圖譜處理軟件）+流動(dòng)相二.操作流程0準(zhǔn)備工作確定色譜實(shí)驗(yàn)方法，處理好流動(dòng)相1換好流動(dòng)相，確定色譜柱選擇無誤1開機(jī)打開泵開關(guān)，聽到兩聲“嘀”的響聲之后，再打開波長檢測器。檢測器進(jìn)入預(yù)熱階 段（此時(shí)檢測器面板進(jìn)入5min倒計(jì)時(shí)）這期間打開電腦，進(jìn)入英文windows操作系統(tǒng),待檢測器自檢完畢（整個(gè)自檢過程約67min）,待檢測器自檢完畢（整個(gè)自檢過程約67min）,(Breeze 軟件）。待程序完全啟動(dòng)，整個(gè)開機(jī)過程結(jié)束。系統(tǒng)默認(rèn)進(jìn)入上次使用的方案

2、。2建立新方法和新方案2.1新建方案方案主要用來儲(chǔ)存你的各個(gè)實(shí)驗(yàn)方法，數(shù)據(jù)等內(nèi)容，你可以把它理解為一個(gè)文件夾。Manage Breezename中輸入方案2.1.1創(chuàng)建步驟Manage Breezename中輸入方案選擇名稱（如abc）, comments中可填注釋，也可不填。一單擊finish界面下一單擊2.1.2界面下一單擊Manage Breezef在f在project中找到你創(chuàng)建的方案（如abc）f點(diǎn)擊OK，即進(jìn)入到我們自己的方案中了2.2新建方法在新建的方案中，需要建立不同的試驗(yàn)方法。試驗(yàn)方法主要設(shè)定的包括洗脫方式, 檢測波長等參數(shù)。2.2.1新建方法步驟單擊f單擊單擊f單擊（Flo

3、w選項(xiàng)卡）f在programmed flow中設(shè)定你的洗脫方式（此步在2.2.2詳述）f單擊G 亡n eralChannel 1 Channel 2 Analog A Analog BEventsG 亡n eralChannel 1 Channel 2 Analog A Analog BEvents（channel 1 選項(xiàng) 卡）f在wavelength框內(nèi)設(shè)定你的檢測波長（如265nm,280nm,215nm等等）（設(shè)定結(jié)Edit View Messages HelpExitFile束，保存）：單擊f輸入方法名稱如（abc 1）f單擊save2.2.2洗脫方式的設(shè)定（重要）在 program

4、med flow 中可看至在 programmed flow 中可看至U。其中Isocratic為等度洗脫，Gradient為梯度洗脫。以下我們來分述。2.2.2.1 若你用等度時(shí)（Isocratic）： pump mode中選擇Isocratic表格中Isocratic Flow A為流動(dòng)相A的流速/Isocratic Flow B為流動(dòng)相B的流速,Total Flow 為總流速。例如：假設(shè)方法要求用乙腈做A相，用純水做B相，乙腈占70%,水占30%，等度，貝I：I IUl I II I I1-1-! I ILJYYPump M ode: 11 socraticIsocratic Flow

5、AIsocratic Flow El :T otal Flow :(ml/min)(ml/min)ml/min|0.70|0.30|1.002.2.2.2 若你用梯度時(shí)（Gradient）： pump mode中選擇Gradient表格中第1行默認(rèn)已有，單擊下面空白行處添加新行。Time為時(shí)間，即此行開始時(shí)間；Flow不作更改，保持1ml/min的總流速；%A處填A(yù)相比例；%B處填B相比例；curve處為曲線型號，一般不變。例如:假設(shè)用方法要求乙腈做A相，用純水做B相,010min乙腈從100%到50%； 1030min乙腈從50%到40%； 3060min乙腈從40%到80%；則:洗脫設(shè)置完

6、畢繼續(xù)按照2.2.1洗脫設(shè)置完畢繼續(xù)按照2.2.1完成方案的創(chuàng)建。3洗泵和平衡方法設(shè)定完畢，我們還要進(jìn)行洗泵與平衡兩項(xiàng)工作，讓機(jī)器做好進(jìn)樣前的準(zhǔn)備。3.1洗泵在更換流動(dòng)相，第一次使用機(jī)器，長時(shí)間未使用的情況下需要進(jìn)行洗泵的工作。步驟 畫Pump Mode: Gradient壬Time (min)Flow (mlAnin)%ACurve11.00100.00.0210.001.0050.050.06330.001.0040.060.06460.001.0080.020.06如下：單擊I（purge pump）next按指示圖操作：打開泵面板，取塑料注射器，扭開排液閥旋鈕，用注射器抽取泵中液體10

7、ml左右（無氣泡即可），反向扭緊旋鈕，取出注 射器。根據(jù)需要灌洗AB泵。單擊next按圖示操作：向左打開參比閥，單擊next（即 是對AB泵以默認(rèn)的5mi/min的流速進(jìn)行沖洗，若只充一個(gè)泵，只選一個(gè)即可。）默認(rèn)沖洗 時(shí)間5min，5min后自動(dòng)停止，向右關(guān)緊參比閥finish結(jié)束洗泵3.2平衡洗完泵后，還要將色譜柱內(nèi)雜質(zhì)洗凈。所以我們需要進(jìn)行平衡。在每次進(jìn)樣前，我們equilibrate）equilibrate）在彈出的對話框選擇所需方法（一般為你的實(shí)驗(yàn)方法，如abcl）待基線穩(wěn)定，且達(dá)到小數(shù)點(diǎn)后5位數(shù)字4的時(shí)候，即可停止洗平衡（一般十幾鐘到幾十分鐘不等）4.進(jìn)樣(abort)平衡好之后，即

8、可進(jìn)樣（請先將注射器中樣品準(zhǔn)備好衡（一般十幾鐘到幾十分鐘不等）4.進(jìn)樣(abort)平衡好之后，即可進(jìn)樣（請先將注射器中樣品準(zhǔn)備好5）進(jìn)樣步驟如下：單擊1(singleinjetion）在出現(xiàn)的對話框中輸入進(jìn)樣名稱，方法，進(jìn)樣體積（一般為10ul）,時(shí)間等內(nèi)容,Method:zzdinject Samples-Increment after Each InjectionOptions.- Keep Dialog Open after Inject例如CancelHelp設(shè)置好之后fMethod:zzdinject Samples-Increment after Each InjectionOp

9、tions.- Keep Dialog Open after Inject例如CancelHelp設(shè)置好之后f單擊injectSpecify Single InjecLParametej-sSample Name: mihu505 no.5Function:按鈕f等到操作動(dòng)畫出現(xiàn)時(shí)，將進(jìn)樣環(huán)手柄搬到load位置，平穩(wěn)插入微量注射器，均勻恒 速注入樣品液，除另有規(guī)定外，不應(yīng)立即取下注射器，手柄搬到inject位置，即開始出現(xiàn)圖像f點(diǎn)擊(send date to review)出現(xiàn)大視圖f等到樣品跑結(jié)束，自動(dòng)出現(xiàn)結(jié)果圖。(中途可以按中止(abort )停止進(jìn)樣5數(shù)據(jù)處理得出了色譜圖，下一步就是對色

10、譜圖各峰的統(tǒng)計(jì)，并得出最終結(jié)果。5.1統(tǒng)計(jì)各峰時(shí)間，面積，高度等內(nèi)容。步驟如下:(channels5.1統(tǒng)計(jì)各峰時(shí)間，面積，高度等內(nèi)容。步驟如下:(channels選項(xiàng)卡)找到你需要處理的內(nèi)容雙擊打開7擊processing parameters燈 Start New Processing Parameterswizard)選擇，單擊okf可輸入統(tǒng)計(jì)開始時(shí)間和結(jié) Clear Peak Width and Threshold束時(shí)間，也可不輸，單擊next注意不要選上，單擊next可輸入統(tǒng)計(jì)最小面積或最小峰高，也可不輸，單擊nextJ單擊nextJ單擊next f單擊next單擊next輸入名稱，

11、單擊finish出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)表格：此時(shí)建議右鍵選中某些不重要的行，并單擊delete row(s)進(jìn)行刪除，只留下需要的幾行數(shù)據(jù)即可f點(diǎn)擊(saveall)，統(tǒng)計(jì)操作結(jié)束。5.2得出結(jié)果圖。步驟如下：FindData點(diǎn)擊點(diǎn)擊Curves 上+ia占etg Inj已ctiung | Chann已怎hlethdcJs Result SetgCurves 點(diǎn)擊（results選項(xiàng)卡）找到你需要處理的內(nèi)容，右鍵單擊那一個(gè)結(jié)果行一單擊SampleNameVial InjectionSarnpl 已TypeChannelDe scription1tiepiS 111Unknown2SampleNameVial

12、 InjectionSarnpl 已TypeChannelDe scription1tiepiS 111Unknown2rnihuSUS no.111Unknown3tie)3i2111Unknown斗tongf：ii2 111Unknown5tongpiS 411Unknown6tongpi2 311Unknown7tonqf：ii2 211Unknown8tongpiS 111Unknown9tongpil 211Unknown10tongpil 311Unknown11tongpil 411Unknown12tiepi2 611UnknownReviewCopy To Froje匚Vie

13、w AsDelete Row(s)Print TableFT已”i已卩丿FT 匚 ess.Print.Export.CopyPaste.AcquisitionMethodDateFroc已空:已dProcessingMethod|1CI429 35/9/201110:21:37 AMCI429 3 UV Ch1CI429 35Z8/20115:22:53 PMCI429 3 UV ChiCI429 35Z8Z201111:29:34 AMCI429 3 UV ChiCI429 3S.S.QO118:58:45 AMCI429 3 UV Chicl429 35/8/20118:30:19 AMc

14、l429 3 UV ChiCI429 3S-Y-QOn8:44:07 FMCI429 3 UV ChiCI429 3S-Y-QCI116:25:54 PMCI429 3 UV Chil：I429 35.-7.-,20114:39:45 PMcl429 3 UV ChiCI429 3S-Y-QOn4:28:02 PMCI429 3 UV ChiCI429 3S-Y-QCI114:25:35 PMCI429 3 UV ChiCI429 3S-Y-QCI112:57:01 PMCI429 3 UV ChiMCI429 3S-Y-QOn2:11:54 PMCI429 3 UV ChiDateAcqui

15、red(preview)f對話框中選（也可以選第三個(gè)自己選擇顯示模式，但一般選擇第二個(gè)即可），單擊OK-以選第三個(gè)自己選擇顯示模式，但一般選擇第二個(gè)即可），單擊OK-單擊a|(print)即打印出來實(shí)驗(yàn)結(jié)果（當(dāng)然也可以保存此實(shí)驗(yàn)報(bào)告，單擊file單擊save report即可）6.關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前用純有機(jī)相（最好是甲醇）洗平衡以保存柱子。洗干凈后停止平衡一單擊fileRumps Rurming ALExitYou are exiting with pumps still running. Do vu want to:圧 Shut Pumps Do艸nLeave Pumps RunningOK. |

16、Cancel IHelpOK. | Cancel IHelp單擊exit 一彈出單擊OK單擊exit 一彈出檢測器，最后關(guān)掉泵及總電源。注釋161流動(dòng)相的前處理：一般來說，流動(dòng)相與試液均需過濾與除氣泡后才能進(jìn)入色譜。過濾：用 注射器加濾頭進(jìn)行過濾，或者用專用過濾裝置。除氣泡：將過濾后的流動(dòng)相或試樣放在超聲 波里超聲30min以上，至無氣泡逸出即可。2.英文windows系統(tǒng)：學(xué)校電腦即是開機(jī)的第一個(gè)默認(rèn)的windows，無需選擇，直接按回車進(jìn)入系統(tǒng)即可3.存儲(chǔ)過你的方法之后（如abc 1）,下次開機(jī),打開你的方案（如abc）之后，可在view method 中找到你保存的方法（單擊file單擊

17、open，再找到打開即可）。方法也可進(jìn)行更改，更 改后可以選擇覆蓋保存于另存為。按鈕,4平衡結(jié)束需要滿足以下兩個(gè)條件：按鈕,（1）平衡圖像已經(jīng)穩(wěn)定，沒有出峰的跡象了（可在平衡時(shí)使用圖像左側(cè)的在激活狀態(tài)下按右鍵可以調(diào)出更改時(shí)間坐標(biāo)的對話框：，更改數(shù)字即可改變時(shí)間坐標(biāo)顯示范圍，便于，更改數(shù)字即可改變時(shí)間坐標(biāo)顯示范圍，便于判斷是否還有出峰跡象）（2）平衡圖像縱坐標(biāo)是否穩(wěn)定在小數(shù)點(diǎn)后五位或更多位。如下圖，即縱坐標(biāo)數(shù)字已到達(dá)小數(shù)點(diǎn)五位，即可。數(shù)點(diǎn)五位，即可。5微量注射器在吸取樣品前應(yīng)先用純有機(jī)相洗（如純甲醇），再用樣品潤洗三次并除去針管 內(nèi)起泡后，吸取10ul樣品備用（針頭的殘葉可用濾紙擦去）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前用純有機(jī)相洗干凈 注射器內(nèi)壁（也就是反復(fù)抽取幾次），再把注射器裝好。6所有的實(shí)驗(yàn)圖，方法，結(jié)果，都可在find