骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)在骨折愈合實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用

1、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)在骨折愈合實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用摘要：骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是對骨組織進(jìn)展定量描繪的一門技術(shù)。目前用于骨質(zhì)疏松的研究較多，但用于骨折愈合的研究不多?；貞浟嗽摲椒ㄔ诠钦塾蠈?shí)驗(yàn)研究中的主要技術(shù)步驟及我們的經(jīng)歷，并對相關(guān)參數(shù)做了詳細(xì)描繪。關(guān)鍵詞：骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)；骨折愈合；實(shí)驗(yàn)研究1引言骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)Bnehistrphetry，是對骨組織進(jìn)展定量描繪的一門技術(shù)，目前主要通過對顯微鏡下骨組織二維平面的測量，根據(jù)體視學(xué)原理，推測或轉(zhuǎn)換獲得三維參數(shù)1。其根本原理為avalieri原理和Delesse原理。avalieri原理由17世紀(jì)意大利數(shù)學(xué)家avalieri提出，其含義是將物體等距做數(shù)個切面

2、，各切面的面積之和a與切面之間間隔 d的乘積，即可求得物體的絕對體積，用公式表示為：V=ad。Delesse原理由19世紀(jì)法國地質(zhì)學(xué)家Delesse提出，是最根本、最簡單、最實(shí)用的原理之一，用它可求得面積分?jǐn)?shù)面積密度AA和體積分?jǐn)?shù)體積密度VV，用公式表示為：AA=A/A=VVA為切面內(nèi)特征物面積之和，A為切面內(nèi)參照面積之和。體視學(xué)在材料學(xué)、地質(zhì)學(xué)中開展較早，稱“定量金相。1968年，國際體視學(xué)會成立，開場并迅速普遍用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過1973年3月加拿大、1976年3月法國、1980年3月美國3次骨組織測量學(xué)國際學(xué)術(shù)會的召開，為該方法在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用打下了基床2。1988年，中國體視學(xué)學(xué)會和

3、中國生物醫(yī)學(xué)體視學(xué)會正式成立，體視學(xué)的方法開場在國內(nèi)得到推廣和應(yīng)用。因此，骨組織計(jì)量學(xué)用于骨科在國內(nèi)僅10余年時間。目前應(yīng)用最多的是用于骨質(zhì)疏松的研究，而在骨折愈合中那么較少，二者盡管有許多一樣的地方，卻也存在明顯不同，對此尚需進(jìn)一步討論。2主要技術(shù)步驟根據(jù)我們的經(jīng)歷，其主要技術(shù)步驟為標(biāo)本制備采圖測量轉(zhuǎn)換為參數(shù)結(jié)論。21標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)動物選家兔比大鼠好，因其更易制作硬切片。涉及到四環(huán)素標(biāo)記、取材、固定、脫水、包埋、制片、染色等步驟。2.1.1四環(huán)素標(biāo)記假設(shè)要獲得動態(tài)參數(shù)，需對動物行四環(huán)素族藥物活體標(biāo)記，如四環(huán)素、土霉素、金霉素口服或肌注均可，目的是理解骨礦化動態(tài)過程。進(jìn)展雙標(biāo)時為獲得可靠標(biāo)記結(jié)果

4、，每次標(biāo)記最好連續(xù)2天，末次標(biāo)記在取材前23天，2次標(biāo)記間隔時間兔以6天為最正確。如第4、5天行第一次標(biāo)記，那么第11、12天行第二次標(biāo)記。2.1.2取材一般在兔橈骨中段造成3寬缺損后，以該處為中心共取2長橈骨標(biāo)本。動作要輕柔，以防再次骨折影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.1.3固定一般采用10%的福爾馬林緩沖液pH7.07.1或70%乙醇或100%乙醇固定3天。對于四環(huán)素標(biāo)記的標(biāo)本以乙醇固定為好，福爾馬林溶液可使標(biāo)記的顏色減退。2.1.4脫水用酒精從低濃度到高濃度梯度脫水，假設(shè)采用80%的固定濃度那么勿需脫水。2.1.5包埋包埋劑一般用甲基丙烯酸甲酯和鄰苯二甲酸二丁酯，臨用時以31比例混合，加過氧化苯甲

5、酯適量，可起催化作用。包埋過程中注意負(fù)壓抽氣，防止氣泡形成。2.1.6制片傳統(tǒng)對骨組織形態(tài)構(gòu)造的觀察，一般多用硬骨磨片和脫鈣后切片。這些方法各有其不如人意之處，如：硬骨磨片易破裂、不完好；脫鈣后切片易變形、失真，使骨組織很重要的成分礦物質(zhì)喪失。目前，在骨組織的形態(tài)計(jì)量學(xué)研究中，學(xué)者們都認(rèn)為采用鋸片后磨片和不脫鈣切片較為理想3。但我們認(rèn)為，鋸片后磨片費(fèi)時、費(fèi)力，過程復(fù)雜，一般研究人員難以掌握，其片子厚度也較厚，約為2030，由于投影過多、投影過少、截尾效應(yīng)將影響局部數(shù)據(jù)的觀察；而采用JungK、LEiAS等重型切骨機(jī)行不脫鈣切片，根據(jù)需要，可準(zhǔn)確獲得不同厚度的切片510，簡捷、省時、準(zhǔn)確。2.1

6、.7染色染色方法需根據(jù)測量目的而選擇，如Tluidineblue甲苯胺藍(lán)，可明晰地顯示礦化骨小梁、類骨質(zhì)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞；assn染色可明晰區(qū)分類骨質(zhì)、礦化骨小梁，但不易區(qū)分細(xì)胞；HE染色可區(qū)分細(xì)胞，但不如甲苯胺藍(lán)明晰。其他4尚有VnKssa氏法、SlhreyaninR、GldnensTrihre等，還有像改進(jìn)的Giesa、PAS、AB-PAS等。每一種染色方法，無論單一的還是復(fù)合的，都使各種組織成分有特定的著色，以便于鏡下準(zhǔn)確地識別。22采圖如今一般都采用一套將顯微攝像與計(jì)算機(jī)相連的特殊圖像采集系統(tǒng)如NiknSpt圖像采集系統(tǒng)采圖。采圖需注意樣本的代表性與可比性。應(yīng)遵循等距隨機(jī)抽樣的原那

7、么；同一標(biāo)本的照片或視場數(shù)的增加并不代表實(shí)際研究例數(shù)的增加；不同標(biāo)本的采圖部位應(yīng)根本一致，如均在外骨痂或內(nèi)骨痂，以使其具有可比性。采圖的同時最好用標(biāo)尺定好標(biāo)。23測量切片制成后就可以進(jìn)展測量，目前較常用的測量方法有3種2，3種方法都是根據(jù)Delesse原理，即根據(jù)平面的測量推測或轉(zhuǎn)換為三維的參數(shù)。第一種方法為目鏡測量盤測量法，第二種方法為電子計(jì)算機(jī)圖像測量法，第三種方法為半自動圖像分析法。前兩種方法均有各自的缺點(diǎn)，第三種方法具備了前兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，且防止了二者的缺乏，故為最常用的方法。一個特制的數(shù)據(jù)計(jì)算盤和一個發(fā)光的游標(biāo)或畫筆與顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)聯(lián)結(jié)，即可進(jìn)展半自動圖像分析。工作時數(shù)據(jù)盤與游標(biāo)映

8、入鏡下，與切片的圖像重疊，游標(biāo)在數(shù)據(jù)上的挪動猶如在切片的圖像上挪動。這樣游標(biāo)上的光點(diǎn)沿著欲測的組織構(gòu)造挪動便可以進(jìn)展點(diǎn)計(jì)數(shù)、直線或曲線長度、周長及面積的測量。數(shù)據(jù)盤的邊緣局部設(shè)有詳細(xì)程序，根據(jù)需要可選擇相應(yīng)的程序進(jìn)展測量，在與數(shù)據(jù)盤相接的微處理機(jī)上顯示測量的數(shù)據(jù)。24骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)上述測量僅測出了特征物的二維長度和面積點(diǎn)計(jì)數(shù)除外，根據(jù)體視學(xué)原理，尚需轉(zhuǎn)換為三維參數(shù)。這樣，二維的長度與面積應(yīng)理解為三維的面積與體積。如今有專門的骨科軟件可供使用，假設(shè)無，那么需代入相應(yīng)公式計(jì)算。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)共60多個，詳細(xì)可分為靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)，常用于研究骨折愈合的參數(shù)57有：2.4.1靜態(tài)參數(shù)類骨

9、質(zhì)均寬steididth，.i：將類骨質(zhì)測n次寬度后，取平均值。公式：.i=類骨質(zhì)寬度之和/n類骨質(zhì)外表steidsurfae，S：指類骨質(zhì)外表長度占骨小梁外表長度的比例。公式：S=類骨質(zhì)外表長度/骨小梁外表長度%類骨質(zhì)體積steidvlue，V：類骨質(zhì)面積占骨組織面積的比例。也叫類骨質(zhì)體積密度、體積分?jǐn)?shù)、面積分?jǐn)?shù)。公式：V=類骨質(zhì)面積/骨組織面積%成骨細(xì)胞指數(shù)：指每1骨小梁外表長度平均成骨細(xì)胞個數(shù)個/。礦化骨痂均寬ineralizatinidth，L：將礦化骨痂測n次寬度后，取平均值。礦化骨痂體積ineralizatinvlue，LV：為礦化骨痂面積占骨組織面積的比例。其含義及公式同類骨質(zhì)體

10、積%。破骨細(xì)胞吸收外表stelastiresrptinsurfaes，RS：指Huseship陷窩的外表長度與骨小梁外表長度的比值%。破骨細(xì)胞指數(shù)：指每1骨小梁外表長度平均破骨細(xì)胞個數(shù)個/。上述為骨的形成參數(shù)，為骨的構(gòu)造參數(shù)，為骨的吸收參數(shù)。2.4.2動態(tài)參數(shù)礦化率ineralizitinrate，AR：指每日在活性成骨外表新沉積的礦化骨厚度。AR=雙標(biāo)記帶平均寬度/雙標(biāo)記間隔天數(shù)/d糾正礦化率Adjustedineralizatinrate，jAR：jAR=AR雙標(biāo)長度/類骨質(zhì)外表長度/d礦化延遲時間ineralizatinlagtie：類骨質(zhì)寬度除以糾正礦化率即為礦化延遲時間。骨形成率Bn

11、efratinrate，BFR：BFR=礦化率單標(biāo)長度骨小梁外表長度/骨小梁面積1002/d。骨吸收率Bneersinrate，BER：BER=吸收陷窩深度/吸收陷窩外表長度平均骨壁厚度/AR2/d平均骨壁厚度是粘和線到骨小梁外表的間隔 ，甲苯胺藍(lán)染色不易觀察，需用特定的染色方法。其他尚有骨重建周期、雙標(biāo)記外表和單標(biāo)記外表等參數(shù)。3結(jié)語骨組織計(jì)量學(xué)與骨折愈合的研究，盡管費(fèi)時、費(fèi)力、所需設(shè)備昂貴，但它使得過去對骨折的“定性或間接認(rèn)識上升到“定量或直接認(rèn)識的新高度。在此過程中仍需強(qiáng)調(diào)的是，必須遵循隨機(jī)抽樣、采圖并忠實(shí)記錄等原那么。分析參數(shù)時，應(yīng)結(jié)合骨折愈合的不同時期，靜、動態(tài)參數(shù)的比照分析，如類骨質(zhì)并非在各時期都是越多越好，假設(shè)在后期類骨質(zhì)多，礦化率低，說明成骨細(xì)胞功能活潑，但骨折愈合的關(guān)鍵一環(huán)礦化存在障礙。必要時還應(yīng)結(jié)合其他生化指標(biāo)、生物力學(xué)指標(biāo)進(jìn)展分析，方可得出可靠結(jié)論。參考文獻(xiàn)：1iliaAP.Bneandineralresearh.Asterdan:Exeptaedia,1983.191-222.2黨耕町.骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)J.中華骨科雜志，1989，27(1):57-59.3黃蓮芳，李青南.不脫鈣骨標(biāo)本制片技術(shù)的討論J.廣東解剖學(xué)通報(bào)，1994，16(2):151-153.4席越，王戈平.骨組