高脂血癥對(duì)孕期大鼠急性胰腺炎的影響

1、高脂血癥對(duì)孕期大鼠急性胰腺炎的影響【摘要】目的：討論高脂血癥對(duì)孕期大鼠急性胰腺炎(AP)的影響。方法：妊娠大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(高脂飼料)和對(duì)照組(平衡飼料)，分別喂養(yǎng)16d后，用L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arg)溶液(250g/100g)進(jìn)展腹腔注射，1h后再次腹腔內(nèi)注射(200g/100g)。計(jì)算48h內(nèi)大鼠死亡率，分別于末次注射后0、12、24和48h檢測(cè)血清甘油三酯(TG)、淀粉酶(AS)和脂肪酶(LPS)；計(jì)算胰腺濕/干重比值；觀察胰腺組織的病理變化并評(píng)分，免疫組化SP法檢測(cè)胰腺組織Bax表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組死亡率8.3%，對(duì)照組0.0%。實(shí)驗(yàn)組TG較對(duì)照組明顯升高(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組AS

2、、LPS峰值分別在24、12h出現(xiàn)，對(duì)照組都在24h出現(xiàn)且明顯較實(shí)驗(yàn)組低(P0.05)。在L-Arg末次注射后12、24h，實(shí)驗(yàn)組胰腺濕/干重比值較對(duì)照組升高(P0.05)，胰腺水腫出血、炎癥浸潤(rùn)也較對(duì)照組更重，病理評(píng)分更高(P0.05)。Bax表達(dá)的峰值提早出現(xiàn)，且比對(duì)照組高(P0.05)。結(jié)論：高脂血癥能使L-Arg誘導(dǎo)的孕期AP提早出現(xiàn)，在此過(guò)程中凋亡基因Bax可能參與誘導(dǎo)胰腺腺泡的凋亡，從而減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度?！娟P(guān)鍵詞】孕期；高脂血癥；急性胰腺炎；精氨酸Abstratbjetive:Tstudytheinfluenefhyperlipeianautepanreatits(AP)fra

3、tsduringpregnany.ethds:SDratsinpregnanyererandlydividedintthetestgrupandthentrlgrup，fedfr16daysseparately.RatsinpregnanyeregivenintraperitnealinjetinithL-argininefr2ties(thefirsttie250g/100g,thesendtie200g/100g)atanintervalfnehur.Afterthelastinjetin,thertalityfratsinpregnanyithin48hursalulated.These

4、rutriglyeride(TG)、seruaylase(AS)、lypase(LPS)frbldsaplesandet/dryratifpanreaseretestedatthepintf0、12、24and48hurs.Thepanreatihistpathlgialsrebasednirspihangesasevaluated.TheexpressinfBaxprtEinasdeterinedbySPiunhistheialtehnique.Results:Afterthelastinjetin,thertalityfthetestgrupas8.3%,but0.0%fthentrlgr

5、up.ThelevelfTGinthetestgrupashigherthanthatfthentrlgrup.AS、LPSinthetestgruppeakedat24-and12-hurindividuallyhileAS、LPSinthentrlgrupbthpeakedat24-hurandlerthanthatfthetestgrupbviusly(P0.05).parediththentrlgrup,theet/dryratifpanreasftestgrupinreasedat12-and24-hur(P0.05).Thepathlgialhangesfpanreasftestg

6、ruperereseriusandthepanreatihistpathlgialsreasalshigher,iththeexpressinftheBaxprteinserius,t.nlusin:L-Arg-indued-APduringpregnanyuldappearaheadfshedulebeasusefhyperlipeia.BaxgeneayntributetainarellapptsisandreduetheseverityfAP.Keyrdspregnany;hyperlipeia；autepanreatitis；L-arginine1材料與方法1.1動(dòng)物安康性成熟SD大鼠

7、雌性48只(體質(zhì)量180220g)，雄性24只(體質(zhì)量220250g)，均由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2試劑與儀器L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arg)，分析純級(jí)(BBI公司，加拿大)。使用時(shí)用體積分?jǐn)?shù)0.9%的NS配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的L-Arg溶液(pH7.0)。Bax抗體免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程，中國(guó))，盒中抗體為兔抗Bax(Santa-ruz公司，美國(guó))。X9全自動(dòng)生化分析儀、電熱恒溫枯燥箱、低溫高速離心機(jī)(貝克曼公司，美國(guó))，1604型精細(xì)電子天平(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠，中國(guó))，SPT及IPP圖像采集分析系統(tǒng)(ediaybernetis公司，美國(guó))。1.3方法1.3.1動(dòng)物分

8、組及模型制備大鼠按雌雄比(21)合籠進(jìn)展交配，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房(22)，給予規(guī)律光照(12h12h)，自由飲食。發(fā)現(xiàn)有陰道栓后記為妊娠第1d，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組高脂飼料(83的平衡飼料，15的豬油，2的膽固醇)和對(duì)照組(平衡飼料)，每組24只。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。兩組分別喂養(yǎng)16d后，用L-Arg溶液先于腹腔內(nèi)注射(250g/100g)，1h后，再次腹腔注射(200g/100g)。1.3.2標(biāo)本制備兩組分別于末次注射L-Arg溶液后0、12、24和48h各取6只處死(如處死時(shí)未發(fā)現(xiàn)大鼠懷孕，不納入實(shí)驗(yàn))，取門(mén)靜脈血，別離血清，-70冰箱保存。同時(shí)切取大鼠胰腺組織，一分為二，一局

9、部備于胰腺濕/干比率測(cè)定，另一局部用多聚甲醛固定，石蠟包埋，備用于組織病理學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè)。1.4觀察指標(biāo)1.4.1兩組死亡率觀察兩組在注射后各時(shí)間點(diǎn)的死亡情況并計(jì)算其死亡率。1.4.2血清TG和淀粉酶(AS)、脂肪酶(LPS)用X9全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。1.4.3胰腺濕/干重比值兩組大鼠于各時(shí)間點(diǎn)處死后，切取的胰腺組織于電子天平上稱重(濕質(zhì)量)；再將切取的胰腺組織于60烘干24h，至質(zhì)量不變?yōu)橹?干質(zhì)量)，計(jì)算濕/干重比值。1.4.4胰腺組織Bax表達(dá)采用免疫組化SP法，其操作步驟嚴(yán)格按SP免疫組化染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)展，結(jié)果判斷：胰腺細(xì)胞胞漿染色呈棕褐色或棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。免疫組化結(jié)果用S

10、PT及IPP圖像采集分析系統(tǒng)處理，4010視野下觀察采集圖像，Iageprplus4.1版專業(yè)圖像分析軟件處理結(jié)果，以平均光密度值表示Bax表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度，由病理科醫(yī)生進(jìn)展雙盲檢驗(yàn)。1.4.5胰腺組織病理學(xué)改變及病理評(píng)分(表1)石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察其病理改變，并按照Shidt鏡下病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)5由病理科醫(yī)生進(jìn)展雙盲評(píng)分。表1胰腺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)略1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)以xs表示，計(jì)量資料結(jié)果采用SPSS11.0軟件進(jìn)展方差分析；組織病理學(xué)評(píng)級(jí)比擬采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為=0.05。2結(jié)果2.1兩組死亡情況實(shí)驗(yàn)組12、24h死1只，24、48h死2只，總死亡率8.3%。對(duì)照組4

11、8h內(nèi)無(wú)死亡。2.2血清TG和AS、LPS的測(cè)定結(jié)果在一樣時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組TG明顯升高(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組的AS、LPS值分別在24、12h出現(xiàn)，而對(duì)照組都在24h出現(xiàn)且明顯比實(shí)驗(yàn)組降低(P0.05，表2)。表2兩組不同時(shí)間點(diǎn)TG、AS和LPS的測(cè)定結(jié)果略2.3胰腺濕/干重比值結(jié)果在12、24h，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組胰腺濕/干重比值明顯升高(P0.05)，在0、48h略有升高(P0.05，表3)。表3兩組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織濕/干重比值結(jié)果略2.4胰腺組織Bax的檢驗(yàn)結(jié)果胰腺組織中Bax表達(dá)于細(xì)胞胞漿，實(shí)驗(yàn)組在12h的平均光密度值最高且比對(duì)照組表達(dá)明顯升高(P與對(duì)照組比1)P0.052)P0.

12、050.05)，而對(duì)照組在24h最高，兩組都隨著時(shí)間點(diǎn)的推移呈下降趨勢(shì)(P0.05，表4)。表4兩組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織Bax的表達(dá)結(jié)果略2.5胰腺組織病理評(píng)分實(shí)驗(yàn)組0h鏡下見(jiàn)局限胰腺小葉間充血，伴有個(gè)別炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但小葉構(gòu)造完好，無(wú)水腫、出血。12h見(jiàn)小葉間明顯充血，局限水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多。24h見(jiàn)腺泡張力加大，腺泡細(xì)胞內(nèi)大量空泡形成，分隔小葉，伴有點(diǎn)狀壞死和出血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。48h小葉間及小葉內(nèi)廣泛重度水腫，小葉構(gòu)造彌漫性破壞、喪失，出血嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。對(duì)照組0、12和24h與實(shí)驗(yàn)組比胰腺病理?yè)p傷明顯減輕(P0.05),48h有所減輕，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。光鏡下，兩

13、組胰腺病理示典型的AP(圖1、2,封2)。表5兩組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果略3討論妊娠合并AP的發(fā)病率為1/10001/50006，發(fā)病時(shí)與同齡女性非妊娠AP相比，其臨床表現(xiàn)和生化指標(biāo)(AS、LPS等)變化明顯。但妊娠期高脂血癥是引起AP的原因或是結(jié)果目前尚不明確。單純?nèi)焉锲诟咧Y尚缺乏以直接導(dǎo)致AP，但在某些狀況(孕婦年齡較大，初次妊娠，糖尿病，前兆子癇以及TG代謝紊亂)下，這種妊娠期血脂生理性升高可能成為導(dǎo)致AP的病理性因素7。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組血清TG明顯升高至正常的3倍左右，說(shuō)明高脂飼料喂養(yǎng)可以在短時(shí)間內(nèi)引起妊娠大鼠TG升高，且較靜脈給藥更符合生理特點(diǎn)。在L-Arg溶液末次注射

14、后0h時(shí)，發(fā)現(xiàn)胰腺病理變化只有血管內(nèi)充血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞水腫等情況，說(shuō)明單純高脂飲食導(dǎo)致的高脂血癥只能引起胰腺病理的細(xì)微改變，尚缺乏引起AP。通常胰腺腺泡細(xì)胞的受損是AP的初始病理變化，一定劑量的L-Arg能減少、抑制核酸及蛋白質(zhì)合成，而胰腺腺泡細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成最為活潑，因此極易受損。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)兩組末次注射L-Arg后都發(fā)現(xiàn)胰腺有明顯的炎癥性病理?yè)p害，說(shuō)明L-Arg能成功誘導(dǎo)出大鼠AP。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡程度與AP的輕重程度成負(fù)相關(guān)。誘導(dǎo)凋亡可明顯減輕胰腺炎的病情8，其機(jī)制可能是胰腺炎發(fā)生后出現(xiàn)的炎癥細(xì)胞聚集和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生導(dǎo)致的瀑布樣效應(yīng)是影響胰腺病情的主要因素，而腺

15、泡細(xì)胞的死亡方式?jīng)Q定了瀑布樣反響的程度，進(jìn)而影響AP的病情輕重。Bax基因是凋亡調(diào)控基因Bl-2家族成員，當(dāng)Bax過(guò)表達(dá)時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在12h的平均光密度值最高，而對(duì)照組是在24h最高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的急性炎癥比對(duì)照組提早出現(xiàn)，而隨著時(shí)間點(diǎn)的推移呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明胰腺炎越來(lái)越嚴(yán)重，這可能與高脂血癥的影響有關(guān)。妊娠晚期，合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的胎盤(pán)生乳素有顯著的脂肪分解作用，TG將釋放出大量FFA，而FFA可能通過(guò)以下3種機(jī)制損害腺泡細(xì)胞TG在胰腺中被胎盤(pán)解毒分解，產(chǎn)生過(guò)量的FFA對(duì)腺泡細(xì)胞的直接損傷；FFA誘發(fā)酸中毒，胰蛋白酶原激活加速；胰腺微循環(huán)障礙，而妊娠時(shí)各種內(nèi)分泌激素的分

16、泌、各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的釋放更加重了FFA對(duì)胰腺毛細(xì)血管的損害。本實(shí)驗(yàn)可看出在一樣時(shí)間點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)組TG值遠(yuǎn)比對(duì)照組高，且實(shí)驗(yàn)組在024h間隨著時(shí)間點(diǎn)的推移，TG逐漸下降，說(shuō)明TG可能在此過(guò)程中由于脂肪分解作用大量釋放出FFA,導(dǎo)致腺泡細(xì)胞損害加重。而胰腺腺泡細(xì)胞的損害，加重了AS、LPS的釋放，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組的AS、LPS峰值都比對(duì)照組的提早出現(xiàn)，說(shuō)明高脂血癥能加速AP的誘發(fā)，且病情更重。本研究中，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的胰腺濕/干重比值在12、24h明顯升高(P0.05)，說(shuō)明在1224h這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組胰腺水腫較對(duì)照組重，隨著胰腺組織從水腫向壞死開(kāi)展，在48h時(shí)間點(diǎn)兩組的差異并不大。而胰腺病理在0時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組有血管內(nèi)充血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞水腫等情況，而對(duì)照組在這時(shí)間點(diǎn)根本上無(wú)變化；隨著時(shí)間點(diǎn)的延續(xù)，胰腺損害程度加劇，在12和24h兩組比擬胰腺病理?yè)p傷明顯