實驗4層析技術血清γ球蛋白的分離純化與鑒定課件

1、實驗四 血清球蛋白的分離純化與鑒定層析技術實驗原理實驗思路實驗流程及操作注意事項層 析 技 術1. 定義：層析法，又稱色譜法，是一種廣泛運用的物質分離純化、分析鑒定技術.2. 分離依據(jù)：混合物中各組分的理化性質差異吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。固定相固定不動流動相對固定相作單向相對運動，推動樣品中各組分通過固定相向前移動。各組分理化性質不同，對流動相和固定相具有不同的作用力，因此在流動相推動樣品通過固定相的過程中，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達到分離。3基本原理：固定相和流動相5凝膠層析(凝膠過濾、凝膠色

2、譜、分子篩層析、分子排阻層析)定義：指混合物隨流動相流經(jīng)固定相的層析柱時，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術?；驹恚汗潭ㄏ啵耗z，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結構，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復合凝膠。流動相：洗脫液 pH7.4磷酸鹽緩沖液長鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接凝膠層析的基本原理 樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動而向下移動，同時作垂直向下運動和不定向擴散運動小分子可進入凝膠空內(nèi)部，流程長，速度慢，后流出；大分子不能進入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動，流程短，先流出大小分子彼此分開 影響因素*層析柱的選擇及裝填：柱大小分離樣品量凝膠型號分辨率：各種分子篩

3、的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子/完全滲透分子。*洗脫液：溶解待分離物質，不變性*加樣量：1%5%*凝膠的再生離子交換層析定義: 離子交換層析是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團和流動相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應而進行的分離方法.分類:陰離子交換劑 帶正電荷，與混合物中帶負電的組分結合 陰離子交換層析陽離子交換劑 帶負電荷，與混合物中帶正電的組分結合 陽離子交換層析交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質的有關技術參數(shù)凝膠型號顆粒大?。╩)溶脹體積(ml/g)分離范圍（Mr）G-1040120237102G-15501502.

4、53.5 1.5103G-2550150461103 5103G-50401209111.5103 3104G-754012012153103 8104G-1004012015204103 1105分離依據(jù)：蛋白質理化性質的和個性實驗原理共性：*生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠層析*蛋白質溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷鹽析/有機溶劑沉淀*兩性電解質和等電點：pH pI，蛋白質帶負電；反之帶正電電泳、離子交換層析 *有一定的功能：抗原性 免疫沉淀 個性：蛋白質的分子量、等電點、親水程度、形狀不同實驗思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定上午完成先粗

5、后細下午完成分段鹽析：常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分段鹽析效果好，不易引起變性。溶液pH約4.55.5，可用硫酸/氨水按需要調節(jié)pH值。分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、pI不同，所需的鹽濃度、pH也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調節(jié)鹽濃度及pH可使各種蛋白質分段沉淀。實驗流程及操作注意事項凝膠層析脫鹽：常用透析，需時較長，最好低溫。也可用葡萄糖凝膠G-25/50過柱，用時較短。固定相：sephadex G-25流動相：pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液（0

6、.9%NaCl）原理同前，蛋白質大分子，硫酸銨小分子。濃縮：sephadex G-25吸水，利用高分子性質。電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術：利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術。電泳系統(tǒng)：電泳支持介質、電泳緩沖液、電場鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳電泳用于分離物質的原理 COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PHPI蛋白質為兩性電解質，有一定的等電點，在大于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動，由于各種蛋白質的分子大小與結構不同，所帶表面電荷的多少不

7、同，因而在電場中向陽極移動的速度不同。經(jīng)過一定的電泳時間后可形成許多蛋白質區(qū)帶，每一個區(qū)帶代表一組遷移率相近似的蛋白質。醋酸纖維素薄膜電泳介質：醋酸纖維素薄膜，纖維素的羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。溶于有機溶劑后涂成薄膜，具均一的泡沫狀結構，有強滲透性。 電泳緩沖液：pH8.6的巴比妥緩沖液 清蛋白 pI=4.9 57%72% 1 2%5% 2 pI6 4%9% 6.5%12% pI=7.3 2%20%球蛋白清蛋白 1 2 清蛋白（albumin，A）：3848g/L球蛋白（globulin，G）：1530g/LA/G：正常值1.52.5清蛋白12 加樣線加樣線純化蛋白對照樣品【操作步驟】1點樣：取經(jīng)巴比妥緩沖液浸透的28cm薄膜，濾紙吸去表面多余水分，在無光澤面距一端2cm處用鉛筆劃一加樣線，寫上編號。小濾紙片蘸取血清/樣品，垂直壓在加樣線上，待樣品滲入薄膜，無光澤面向下平貼在電泳槽支架的鹽橋上，靜置510分鐘平衡。點樣端