東平湖沉積物細(xì)菌多樣性分析

1、東平湖沉積物細(xì)菌多樣性分析答 辯 人：宋洪寧指導(dǎo)教師：丁延芹 副教授山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系答辯提綱一、前言二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、結(jié)果與分析四、結(jié)論一、前言1、沉積物微生物 環(huán)境中的微生物總是通過各種信號(hào)傳遞、對(duì)空間和營(yíng)養(yǎng)的相互競(jìng)爭(zhēng)和依賴等作用而形成微生物群落。而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給不均衡、外界環(huán)境條件的改變等因素是造成環(huán)境微生物群落變化的主要原因。沉積物是一個(gè)各種微生物豐富的、物質(zhì)交換頻繁的、生物活性高的特殊環(huán)境，微生物作為物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的主要參與者，在沉積物生態(tài)系統(tǒng)中起著特別重要的作用。 東平湖位于山東省泰安、濟(jì)寧兩市的東平、梁山和汶上三縣交匯地區(qū)，地處大汶河下游，黃河南岸，是山東省第二大

2、淡水湖。其總面積627 km2，總庫(kù)容近40億m3。湖內(nèi)水草生長(zhǎng)旺盛，具有良好的水域生態(tài)環(huán)境和漁業(yè)養(yǎng)殖條件，其中漁業(yè)經(jīng)濟(jì)是沿湖人民的主要生活來(lái)源之一。在東平湖主水源入口附近，有面積為151km2左右的濕地，對(duì)湖區(qū)及其周邊環(huán)境的生態(tài)有著重要的影響。2、本文選題依據(jù)及研究意義 目前，對(duì)東平湖生態(tài)系統(tǒng)的研究主要集中在對(duì)其污染狀況以及水體富營(yíng)養(yǎng)化方面，而對(duì)其生物多樣性的研究較少，尤其是在對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的研究方面，尚處于空白。本文對(duì)東平湖沉積物中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了調(diào)查，并結(jié)合不同環(huán)境因子的差異，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)一步分析和探討了環(huán)境因子對(duì)東平湖沉積物細(xì)菌多樣性的影響。為東平湖微生物生態(tài)研究提供了

3、重要信息，為進(jìn)一步從微生物角度評(píng)價(jià)東平湖生態(tài)系統(tǒng)提供依據(jù)。3、技術(shù)路線總DNA提取純化普通16S引物擴(kuò)增基因掃描限制性酶切純化熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增沉積物樣品樣品總DNA樣品總DNA理化性質(zhì)分析熒光PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物酶切產(chǎn)物T-RFLP圖譜PCA多樣性指數(shù)分析普通PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物16S rDNA文庫(kù)多樣性指數(shù)分析DCARDADCACCA總DNA提取插入片段總DNA提取純化普通16S引物擴(kuò)增基因掃描限制性酶切純化熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增沉積物樣品樣品總DNA樣品總DNA理化性質(zhì)分析熒光PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物酶切產(chǎn)物T-RFLP圖譜PCA多樣性指數(shù)分析普通PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物16S rDNA文庫(kù)多樣性指數(shù)分析DCA

4、RDADCACCA總DNA提取插入片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞總DNA提取純化普通16S引物擴(kuò)增基因掃描限制性酶切純化熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增沉積物樣品樣品總DNA樣品總DNA理化性質(zhì)分析熒光PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物酶切產(chǎn)物T-RFLP圖譜PCA多樣性指數(shù)分析普通PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物16S rDNA文庫(kù)多樣性指數(shù)分析DCARDADCACCA總DNA提取插入片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 本次實(shí)驗(yàn)在東平湖共設(shè)6個(gè)采樣點(diǎn)，1號(hào)點(diǎn)位于淀粉廠排污口附近、2號(hào)點(diǎn)位于水庫(kù)泄洪閘附近、3號(hào)點(diǎn)靠近網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)、4號(hào)點(diǎn)位于湖心、5號(hào)點(diǎn)位于大汶河入口處，6號(hào)點(diǎn)位于東平湖濕地。分別于2008年7月份（大汶河豐水期，樣品標(biāo)記為J）和10月份（大

5、汶河枯水期，樣品標(biāo)記為O）兩次采集樣品。K-B Corer Sampler東平湖部分采樣點(diǎn)圖片123456 圖16 分別拍自：湖心區(qū)（豐）、濕地（豐）、養(yǎng)殖區(qū)（豐）、大汶河入口區(qū)（豐）、養(yǎng)殖區(qū)（枯）、濕地（枯）。分子生物學(xué)分析1、樣品總DNA的提取 樣品基因組總DNA的提取、純化使用E.Z.N. A.Soil DNA Kit進(jìn)行。2、 16S rDNA 的PCR擴(kuò)增 16S rDNA片段擴(kuò)增使用的上游引物為27F，下游引物為1492R；T-RFLP使用的上游引物為27F-FAM，下游引物為1492R。3、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）分析 將純化后的熒光PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶Ms

6、p I進(jìn)行消化，酶切產(chǎn)物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行STR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采用Peak Scanner Softwear v1.0分析。 東平湖沉積物樣品的T-RFLP圖譜4、16S rDNA文庫(kù)的構(gòu)建 將純化后的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD 18-T Vector連接，經(jīng)E. coli 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后根據(jù)藍(lán)白斑挑選陽(yáng)性克隆，構(gòu)建克隆文庫(kù)。東平湖沉積物細(xì)菌16S rDNA文庫(kù)陽(yáng)性克隆子菌液PCR驗(yàn)證部分結(jié)果 M為250 bp DNA Ladder Marker. 16S rDNA文庫(kù)構(gòu)建中ARDRA分型的部分電泳圖譜 將經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后的1427個(gè)陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物進(jìn)行Msp I限制性酶切。

7、選取酶切產(chǎn)物在泳道中條帶分布不同的485個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。12個(gè)樣品的理化性質(zhì) 樣品的總氮(TN)含量用凱氏消化蒸餾定氮法測(cè)定，總磷(TP)用硫酸高氯酸消化鉬藍(lán)比色法，總有機(jī)碳(TOC)用重鉻酸鉀氧化滴定法，銨態(tài)氮(NH-N)和硝態(tài)氮(NO-N)含量分別采用納氏試劑比色法和酚二磺酸比色法進(jìn)行測(cè)定。三、結(jié)果與分析 以T-RFLP圖譜中每一個(gè)可統(tǒng)計(jì)的T-RF（相對(duì)峰面積大于1%）視為一個(gè)OTU，以T-RF的相對(duì)峰面積作為對(duì)應(yīng)的OTU的豐度。根據(jù)圖譜中OTU的種類及其豐度通過BIO-DAP程序進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算。細(xì)菌群落物種的豐富度、多樣性、優(yōu)勢(shì)度和均勻度等分別用Margalef指數(shù)、Shan

8、non-Wiener指數(shù)、 Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)來(lái)測(cè)度。基于T-RFLP的細(xì)菌多樣性分析 根據(jù)T-RFs在不同樣品圖譜中的分布及豐度，采用SPSS軟件對(duì)12個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析(PCA)。 PCA結(jié)果顯示，第一和第二主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為62.7%和9.8%。 從圖中可以看出，所有樣品可以分為兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的群。2O樣品具有較低的第一主成分得分和較高的第二主成分得分，其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其它樣品有明顯的差異，成為1個(gè)獨(dú)立的群；其它的樣品構(gòu)成1個(gè)獨(dú)立的群。基于12個(gè)沉積物樣品T-RFLP的主成分分析東平湖沉積物樣品T-RFs與環(huán)境因子的排序分析基于T-RFLP的DCA(去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析

9、)結(jié)果 基于T-RFLP的CCA(典型對(duì)應(yīng)分析)結(jié)果 圖中，箭頭方向代表變量值的增長(zhǎng)趨勢(shì)，箭頭所處象限表示環(huán)境因子與排序軸之間相關(guān)性的正負(fù)；箭頭長(zhǎng)度表示環(huán)境變量與群落數(shù)據(jù)相關(guān)性的大??；箭頭夾角表示環(huán)境變量間的相關(guān)性大?。环治鰰r(shí)，可以做出某一物種與環(huán)境因子連線的垂線，垂點(diǎn)離箭頭越近，則該種與該因子間正相關(guān)性越大，垂點(diǎn)在延長(zhǎng)線上則表示負(fù)相關(guān)性越大。東平湖沉積物T-RFs與環(huán)境因子的CCA雙序圖東平湖沉積物樣品文庫(kù)庫(kù)容估算 所有獲得的16S rDNA序列都通過RDP II中的Chimera Check軟件進(jìn)行嵌合體檢測(cè)。去除嵌合體序列后，使用FastGroup II 程序?qū)⑾嗨菩源笥?7%的序列視作

10、同一個(gè)OTU。通過RDP Classifier tool release 9.0，按照等級(jí)分類原則將各序列進(jìn)行在線分類，將序列劃分成不同的門、亞門及綱等。文庫(kù)的庫(kù)容利用覆蓋度和“Large Enough”軟件進(jìn)行估算。東平湖沉積物細(xì)菌群落分布東平湖沉積物中16S rDNA文庫(kù)的細(xì)菌多樣性指數(shù) 東平湖沉積物細(xì)菌群落相似性指數(shù)分析 1到6號(hào)采樣點(diǎn)豐水期與枯水期樣品間的Jaccard指數(shù)分別為：0.750、0.364、0.769、0.353、0.500、0.429，可知，除1號(hào)點(diǎn)和3號(hào)點(diǎn)群落結(jié)構(gòu)變化較小外，其余4個(gè)采樣點(diǎn)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生較大變化。而根據(jù)同時(shí)期不同樣品間的相似性指數(shù)分析（見表），東

11、平湖沉積物不同位置的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，尤其是在枯水期。基于16S rDNA文庫(kù)的RDA (冗余分析)結(jié)果基于16S rDNA文庫(kù)DCA結(jié)果 東平湖沉積物樣品16S rDNA文庫(kù)數(shù)據(jù)與環(huán)境因子的排序分析基于16S rDNA文庫(kù)的RDA雙序圖 -P=-變形桿菌, -P = -變形桿菌, -P = -變形桿菌, Acb = 酸桿菌, Pla = 浮霉菌, -P = -變形桿菌, Bcd = 擬桿菌, -P = -變形桿菌, Fir = 厚壁菌, Ver = 疣微菌, Nit = 硝化螺旋菌, Chx = 綠彎菌, Gem = 芽單胞菌, Chb = 綠菌門, Cya = 藍(lán)藻門, Def = 脫

12、鐵桿菌. 四、結(jié)論1、分子生物學(xué)方法的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，T-RFLP數(shù)據(jù)的分析結(jié)果更全面地考查細(xì)菌群落在空間及時(shí)間上呈現(xiàn)的差異，而16S rDNA文庫(kù)的分析結(jié)果則有利于更具體地分析沉積物中細(xì)菌群落的組成。本實(shí)驗(yàn)中由兩種方法所得出的數(shù)據(jù)在分析過程中起到了良好的互補(bǔ)作用，為獲得更為全面、準(zhǔn)確的分析結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。2 東平湖沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 東平湖沉積物細(xì)菌群落主要由變形桿菌門（包括、 、 、和亞門)、酸桿菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、綠菌門、藍(lán)藻門、脫鐵桿菌門、放線菌門、螺旋體門以及待劃分類群OP8和OP11組成。其微生物群落結(jié)構(gòu)存在著時(shí)間性和空間性差異，-、-和-變形桿菌是沉積物中主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。3 沉積物環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響 基于T-RFLP的CCA和基于16S rDNA文庫(kù)分析的RDA都證實(shí)，沉積物中的總磷含量對(duì)其中的微生物群落結(jié)構(gòu)有著重要影響。盡管尚不能明確環(huán)境因子與微生物群落間的相互作用機(jī)理，但我們的研究結(jié)果初步證實(shí)了環(huán)境因子差異與微生物群落變化之間存在的相關(guān)性，并對(duì)部分細(xì)菌群落的分布變化做出了環(huán)境解釋。 研究結(jié)果表明，東平湖沉積物細(xì)菌多樣性受到了人為活動(dòng)的嚴(yán)重影響，而由此引起的對(duì)整個(gè)東平湖生態(tài)系統(tǒng)的影響尚需進(jìn)一步考查