兩大方法幫你搞定質(zhì)粒構(gòu)建

1、兩大方法幫你搞定質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。原理 依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作 用，分別對(duì)目的基因和載體 DNA 進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后， 將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主 細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣，常規(guī)的 T4 連接酶，以及最近更受歡迎 的重組酶方式。下面小編就總結(jié)一下 T4 連接酶與重組酶構(gòu) 建質(zhì)粒方法，通過(guò)比較，其最大的不同點(diǎn)可能在于目的基因 的設(shè)計(jì)以及連接體系。壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 連接酶，可以催化粘端或平 端雙鏈 DNA 或 RNA 的 5-P 末端和 3-OH 末端之間以 磷

2、酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需 ATP 作為輔助因子。質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一 般推薦使用雙酶切。其實(shí)目的就只有一個(gè)，盡量使載體的末 端具有特異性，防止自連。冋選酶切體系VECTOR3 ugCutSmart Buffer5 ul 限制性內(nèi)切酶 11 ul限制性內(nèi)切酶21 ul酶切體系一般選擇50ul，試劑加好之后37C孵育68小 時(shí)，或適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，保證質(zhì)粒酶切完全。每隔一段時(shí)間振 蕩一下并離心以防液滴蒸發(fā)至管蓋上。酶切后載體通過(guò)切膠 回收線性化載體。根據(jù)目的序列構(gòu)建引物后，引物設(shè)計(jì)原則簡(jiǎn)單總結(jié)一下: (1)前向引物：5 端-保護(hù)堿基序列+限制性內(nèi)切酶 1 酶切 位點(diǎn)序列

3、+基因正向引物序列 -3 端(2)反向引物：5 端-保護(hù)堿基序列+限制性內(nèi)切酶 2 酶切 位點(diǎn)序列+基因反向引物序列 -3 端 如果目的基因片段較長(zhǎng)的話，可以選擇 PCR 方式擴(kuò)增目的 基因片段冋選 PCR 擴(kuò)增體系ddH20 :14ul10 xTaq buffer :2ul10um DNTP : 1ul10um primer F : 0.5ul10um primer R : 0.5ul 模 板 DNA : 1ulTaq 酶：1ul冋選 PCR 擴(kuò)增條件(1)95C:5min(2) 35cycle95C:30s55C: 30s (退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定，一般退火溫度根 據(jù)引物 TM

4、 值降低 5度) 72C: 40s(3)72C:10min(4)16C:hold引物擴(kuò)增之后，首先要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小， 然后通過(guò)膠回收，獲得純化目的片段產(chǎn)物.由于加入保護(hù)堿基， 回收產(chǎn)物需要進(jìn)行雙酶切，雙酶切方法與質(zhì)粒酶切方法相同。載體與目的基因的連接，推薦在1020pl反應(yīng)體系中進(jìn) 行接反應(yīng)。25 ng 25 ng 退火 TOC o 1-5 h z 產(chǎn)物2 ul10 x T4 buffer1 ulT4 DNA ligase1 ulT4 連接酶一般選擇 4 度過(guò)夜轉(zhuǎn)化 過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為DH5a ）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為DH5a ），涂板，培養(yǎng)挑取單

5、克隆，并鑒定 挑去平板上的單克隆培養(yǎng)，可以通過(guò) PCR 或者酶切初步鑒 定陽(yáng)性克隆，對(duì)初步鑒定出來(lái)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。下面開(kāi)始重點(diǎn)介紹重組酶構(gòu)建質(zhì)粒，基于同源基因重組原理， 適用于向幾乎任何載體在任何位點(diǎn)進(jìn)行定向克隆，無(wú)需考慮 插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)可高效克隆50 bp10 kb片 段，同時(shí)構(gòu)建時(shí)間也大大縮短。載體的制備一般推薦雙酶切線性化，線性化完全，假陽(yáng)性 克隆低。酶切體系同上。對(duì)于使用重組方式連接來(lái)說(shuō)， PCR 要設(shè)計(jì)引物, 設(shè)計(jì)引 物時(shí)要根據(jù)質(zhì)粒載體和基因序列選擇合適的同源序列，通過(guò) PCR 擴(kuò)增方式進(jìn)行連接， PCR 的產(chǎn)物要純化。 引物設(shè)計(jì)原則簡(jiǎn)單總結(jié)一下：（1）前向引物：5

6、端-上游克隆載體末端同源序列+基因正向擴(kuò)增引物-3 端 (2)反向引物：3 端-基因反向擴(kuò)增引物+下游克隆載體末 端同源序列-5 端 如果設(shè)計(jì)的基因特異插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可以選擇PCR 方式進(jìn)行目的引物的擴(kuò)增。冋選PCR冋選PCR擴(kuò)增體系ddH2014ul10 x Taq buffer2 ul10 um DNTPul10 x Taq buffer2 ul10 um DNTP1 ul10 um primer F0.5 ulVector0.5 ul10 um primer R1 ul10 um primer F0.5 ulVector0.5 ul10 um primer R1 ulTaq

7、酶1 ul冋選 PCR 擴(kuò)增條件(1)95C:5min(2) 35cycle95C:30s55C: 30s (退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定，一般退火溫度根 據(jù)引物 TM 值降低5度) 72C: 40s(3)72C:10min(4)16C:holdPCR 擴(kuò)增后，通過(guò)膠回收方式獲得純化的 PCR 產(chǎn)物。純 化后的 PCR 產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切，直接用于重組反應(yīng)。3. 目的引物與線性載體進(jìn)行重組反應(yīng)?？蛇x重組體系5 x CE II Buffer4 pl線性化克隆載體50 200 ng插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物20 200 ngExnase? II2 pl在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾

8、次 混勻各組分，置于37 C反應(yīng)30 min。待反應(yīng)完成后，立 即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻5 min。重組效率在反應(yīng)30 min 左右達(dá)到最高，反應(yīng)時(shí)間不足或者太長(zhǎng)都將會(huì)降低克隆 效率，這樣大大減少了連接時(shí)間。轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中(一般為DH5a ),涂板，培養(yǎng) 過(guò)夜。挑取單克隆，并鑒定 挑去平板上的單克隆培養(yǎng)，可以通過(guò) PCR 或者酶切初步鑒 定陽(yáng)性克隆，對(duì)初步鑒定出來(lái)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。 最后，幾個(gè)主要注意事項(xiàng)：載體克隆位點(diǎn)選擇盡量選擇無(wú)重復(fù)序列，且 GC 含量比 較均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游 20 bp 區(qū)域內(nèi)GC含量均在40% - 60%范圍之內(nèi)時(shí)，克隆效率將達(dá)到 最大.最適克隆載體與插入片段摩爾比為 1:2，即最適插入片段 使用量為0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以 下公式粗略計(jì)算獲得：最適克隆載體使用量二0.02 x克隆載體堿基對(duì)數(shù)ng (0.03 pmol)最適插入片段使用量 = 0.04 x 插入片段堿基對(duì)數(shù) ng(0.06 pmol)雙酶切 1 和 2，在設(shè)置酶切體系時(shí)要考慮酶切溫度以及 Activity