水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灧椒ㄅc步驟

1、水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灢僮鞣椒ú襟E一、水稻愈傷組織的誘導（一）以水稻幼胚為試材誘導愈傷組織消毒：取水稻未成熟種子（灌漿期），按以下步驟消毒：1）用自來水沖洗種子，去掉浮起的癟谷；2）將種子放入250ml無菌燒杯中（種子數(shù)量約占1/3體積），用200ml 70%酒精消毒2分鐘；（在操凈工作臺上進行無菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸鈉（NaClO）溶液，同時加數(shù)滴吐溫-20，浸泡90分鐘；4）倒去NaClO溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍。誘導與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）1）用鑷子夾住種子，在無菌濾紙上用鋼鉤擠出幼胚，置入誘導培養(yǎng)基中；2）操作完畢后封好培養(yǎng)皿（一般保鮮膜），在暗處適溫下（

2、25-28C ）培養(yǎng)5天；3）繼代培養(yǎng)。用鑷子剝下胚性愈傷組織（去掉芽及膜狀物），置入繼代培養(yǎng)基中（凸 起面向上），暗處適溫下（25-28C）培養(yǎng)3天。（二）以水稻成熟胚為試材誘導愈傷組織消毒：取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消毒:1）將適量種子放入10ml離心管中（100顆左右），倒入75%酒精消毒2分鐘；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分鐘；3）倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸餾水清洗種子5-6遍，最后一遍浸泡30分鐘。誘導與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）1）種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導培養(yǎng)基中，每皿12-14顆；2）操作完畢

3、用封口膜（Micropore TMSurgical Tape）封好培養(yǎng)皿，在28C光照培養(yǎng)箱， 暗培養(yǎng)培養(yǎng)3周；3）在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織（淡黃色，致密 呈球狀，去除種子和芽），置入繼代培養(yǎng)基中，在28 C光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周（2周愈傷組織更為松散）。（如不馬上用，需轉(zhuǎn)移至暗處，于22C繼續(xù)培養(yǎng)1周）二、農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液100W于4ml YEP （含50mg/lKan和50mg/l Str）培養(yǎng)液中，28C, 250rpm振蕩培養(yǎng)20-36h至菌液OD600為0.8-1.0 （顏色接 近橙黃色）。三、共培養(yǎng)和抗性愈傷組織

4、的選擇感菌與共培養(yǎng)：1）取培養(yǎng)好的菌液500山于1.5ml離心管中，4C, 4000rmp，離心2min,去上清。用 含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD600的終濃度為0.01（0.08-0.1 ）；2）將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘；3）將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；4）將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上。25C暗培養(yǎng)2-3天（表面會長有薄薄的一層農(nóng)桿菌）。選擇：1）將愈傷組織取出，用無菌水清洗5-6次（多次洗會更好），其間需不停的振蕩。再 用含250mg/l羧芐青霉素鈉的無菌水清洗12遍。最后置于無菌濾紙上瀝干

5、2小 時；2）將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含250mg/lCarbenicillin （羧芐青霉素鈉）和50mg/l潮霉素 的選擇培養(yǎng)基上進行第一輪選擇，28C，光照培養(yǎng)14天（若農(nóng)桿菌無法抑制，可加 大抗生素濃度，最大用過500mg/l）；3）將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到含250mg/l Carbenicillin和50mg/l潮霉素的培 養(yǎng)基上進行第二輪選擇，28C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。四、抗性愈傷組織的預分化（可選）將新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預分化培養(yǎng)基中，25C，光照培養(yǎng)7天。五、抗性愈傷組織的誘導分化和生根挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)

6、皿或塑料 廣口瓶中（每皿或每瓶放置5-7顆），用封口膜封好，放入恒溫培養(yǎng)室中，28C，光照培養(yǎng) （16h光/8h暗），等待分化成苗（15-30天）。待苗長至1cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗 注：以上一至五的操作步驟皆在無菌條件下進行。六、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽最短時間為兩個月左右。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑 出（苗長至試管頂部，就要及時開蓋），打開封口膜，加入適量蒸餾水或無菌水（防止培養(yǎng) 基長菌），煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長，檢測。附錄：各種母液及培養(yǎng)基的配制方法一、溶液配制0.1%升汞：小心稱取1克HgCl，用少量蒸餾水溶解后，定容至1

7、000ml。25%次氯酸鈉溶液：量取250mlNaClO，用蒸餾水定容至1000ml。激素溶液配制方法：激素溶解方法母液濃度KT加少量稀堿（1M NaOH）溶解，再用蒸餾水定容1 mg/ml6-BA加稀堿（同上）或鹽酸溶解，再用蒸餾水定容1 mg/mlNAA加堿溶解（1M NaOH），再用蒸餾水定容1 mg/ml2，4-D加少量稀堿或酒精溶解，再用蒸餾水定容1 mg/mlABA先用乙醇溶解，再用蒸餾水定容1 mg/ml水稻培養(yǎng)液配方（貯備液）：試劑每10升溶液中的克數(shù)1. nh4no39142. NaH2PO4-2H2O4033. K2SO47144. CaCl28865. MgSO47H2O

8、32406. MnCl2-4H2O15.0(N%) 6-M7O24-4H2O0.74H3BO39.34分別溶解后加500mlZnSO47H2O0.35濃硫酸，然后再加蒸CuSO45H2O0.31餾水到10L。FeCl36H2O77.0檸檬酸（-水合物）119*使用時，每4L培養(yǎng)液中加1號6號貯備液，各5ml。為使水稻生長健壯，可另加SiO 50ppm100ppm。調(diào)節(jié)pH值至5.05.1。、培養(yǎng)基的配制:1.培養(yǎng)基母液配方:1) N6培養(yǎng)基母液(20倍)：每升含：KNO356.6gMgSO4-7H2O2.7gKH2PO48g(NHD2SO49.26gCaCl- 2H2O3.32g2) B5微量

9、母液(100倍)：每升含：KI0.0750gH3BO30.30gMnSO4-H2O1.0gZnSO4-7H2O0.2gNa2MoO4-2H2O0.025gCuSO4-5H2O0.0025gCoCl2-6H2O0.0025g3) B5有機母液：煙酸(VB3)1mg/ml鹽酸毗哆醇(VB6)1mg/ml鹽酸硫胺素(VB1)10 mg/ml肌醇10 mg/ml4) MS培養(yǎng)基大量元素(20倍)：每升含:NH4NO333.0gKNO338.0gCaCl2.2H2O8.8 g(相 當于 CaCl26.644g)MgSO4-7H2O7.4gKH2PO43.4g5）鐵鹽（100倍）：FeSO4-7H2O2.

10、78gNa2EDTA2H2O3.73 g注：FeSO4-7H2O和Na2EDTA-2H2O分別溶解混合后，需加熱煮沸使Fe2借合，最終溶液顏色為深黃色。7） AA大量兀素母液（每升含量）：KCl2.95 gCaCl2-2H2O0.15gMgSO4-7H2O0.25gNaH2PO4-2H2O0.15g2.培養(yǎng)基配方1）粳稻幼胚、成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 g(2.8g)CH :0.3g2,4-D :2.5ml(2ml)蔗糖：

11、30gAgar8gPH值：5. 8注：括號中為成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基成份及用量，其它與幼胚配方相同。以下同2）粳稻幼胚、成熟胚愈傷組織繼代培養(yǎng)基（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 g(2.8g)CH :0.3g6-BA (2,4-D)0.5ml(2ml)NAA（不加）0.5ml蔗糖30gAgar8gPH值：5. 83）秈稻幼胚、成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基（每升含量）：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10mlMS大量兀素：煙酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1

12、ml鹽酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g2,4-D :2.5ml麥芽糖：30gPhytagel:4.0 gPH值：5. 84）粳（秈）稻共培養(yǎng)培養(yǎng)基（每升含量）：N6 （MS）大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇:1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：2 gMES3.9g蔗糖（麥芽糖）： 30gCH :0.5gPhytagel:4.0gPH值：5. 555C時加As至終濃度為200 uM5）選擇培養(yǎng)基（MCH/NCH，秈稻/粳稻）每升含量：MS/N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml

13、煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇:1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g2,4-D :2ml麥芽糖/蔗糖：30gPhytagel:4.0gPH值：5. 8天菌后再加：Carbenicillin250mg/l第一輪選擇：Hyg （潮霉素）50 mg/LCarbenicillin250mg/l第二輪選擇：Hyg （潮霉素）50 mg/L6）粳稻預分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5

14、gCH :0.3g6-BA:2 mlNAA0.1 mlABA5 ml蔗糖：30gPhtagel4.0gPH值5.8天菌后再加Carbenicillin250mg/l7）粳稻分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g6-BA:3 mlNAA0.5 ml蔗糖：30gAgar8 gPH值：5. 88）粳稻生根培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量兀素：25mlB5微量：5ml鐵鹽：5ml煙 酸：0.5ml鹽酸毗哆醇：0.5 ml鹽酸硫胺素：

15、0.5 ml肌 醇：5ml蔗 糖：20gagar:7 g9）秈稻分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：MS大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3gKT:2.5 mlNAA0.5 ml麥芽糖：30gagar:8 gPH值:5. 8Hyg （潮霉素）50 mg/L10）農(nóng)桿菌生長的YEP液體培養(yǎng)基配方（每升含量）：酵母提取物10g蛋白胨10gNaCl5gpH7.0鏈霉素（Str）50mg卡那霉素（Kan）或其它抗生素50mg11）農(nóng)桿菌生長的YM固體培養(yǎng)基配方（每升含量）：KH