藥典2005版-高效液相色譜測含量

1、藥典2005版高效液相色譜法高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。1.對儀器的一般要求所用的儀器為高效液相色譜儀，儀器應(yīng)定期檢定并符合相關(guān)規(guī)定。（1）色譜柱最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手

2、性鍵合填充劑用于對映異構(gòu)體的拆分分析。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充劑，直接影響待測物的保留行為和分離效果，孔徑在15nm以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑使用pH=28的流動相。當(dāng)pH8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH8的流動相時(shí)，應(yīng)選擇耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋率的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當(dāng)需使用pH2的流動相時(shí),應(yīng)選擇耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)

3、鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑等。（2）檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，其它常見的檢測器有二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與待測溶液的濃度有光，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時(shí)記錄待測物在規(guī)定波長范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測物的光譜鑒定和色譜峰的純

4、度檢查。紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與待測溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與待測物的濃度通常不呈線性關(guān)系，必要時(shí)需對響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。不同檢測器對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用的流動相應(yīng)至少符合紫外-可見分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求；采用低波長檢測時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。（3）流動相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機(jī)溶劑的比例通常不低于50%，否則C18鏈的隨

5、機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。但對某些品種，必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求者，可在該品種項(xiàng)下注明。2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)指標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中更具實(shí)用意義的參數(shù)。按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到

6、規(guī)定的要求；如達(dá)不到要求，可對色譜分離條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）在規(guī)定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長度計(jì),R下同，但應(yīng)取相同單位）和半峰高寬（W），按n=5.54（tR/W）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。h/2Rh/2（2）分離度（R）無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。分離度的計(jì)算公式為：2（叫一伽W,+W式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；R2tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；R1W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定

7、外，定量分析時(shí)分離度應(yīng)大于1.5。重復(fù)性取各品種項(xiàng)下的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0。也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80、100和120的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0。拖尾因子(T)為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。拖尾因子計(jì)算公式為：丁=琳百Zd式中W005h為0.05峰高處的峰寬；0.05hdi為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量時(shí)T應(yīng)在0.951.05之間。峰面積法測定時(shí)，T值偏離過

8、大，也會影響小峰的檢測和定量的準(zhǔn)確度。3測定法內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱(量)取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：校正因子隸式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；sar為對照品的峰面積或峰高；RC為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；SCR為對照品的濃度。R再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：式中A為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；xC為供試品

9、（或其雜質(zhì)）的濃度；XA內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；SCs內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為校正因子。當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，使用同一濃度的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，C=C內(nèi)則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。SS（2）外標(biāo)法測定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量或或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。（3）加校正因子的主成分自身對照法

10、測定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照采用相對保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。測定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤海M(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰高約達(dá)滿量程的10%25%或其峰面積能準(zhǔn)確

11、積分通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。（4）不加校正因子的主成分自身對照法當(dāng)沒有雜質(zhì)對照品時(shí)，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的2倍，測量供試品溶液色譜圖

12、上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖I,再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖II。色譜圖I上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖II上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計(jì)算。（5）面積歸一化法由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。方法是測量各雜質(zhì)峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。卵磷脂PC含量的測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用硅膠為填充劑，以異丙醇-正己烷-水（4：0.25：1）為流動相，流速0.7ml/min,檢測波長為206nm,理論板數(shù)按多烯磷脂酰膽堿峰計(jì)算應(yīng)不低于800,分離度應(yīng)符合規(guī)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取多烯磷脂酰膽堿混合對照品各約80mg、120mg、150mg、180mg、200mg和250mg，分別置于10ml量瓶中，加正己烷-異丙醇（2：1）混合溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密兩取上述六種對照品各10p1注入液相色譜儀，以濃度為