分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳

1、電泳基本原理 電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。 許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第一頁，共三十九頁。 電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二頁，共三十九頁。二、主要方法 有支持物的電泳技術(shù)： 1、紙上電泳 2、醋酸纖維薄膜電泳 3、薄層電泳 4、非凝膠性支

2、持體區(qū)帶電泳 （支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等) 5、凝膠支持體區(qū)帶電泳 淀粉液 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三頁，共三十九頁。 不用支持體的電泳技術(shù)： 1、Tiselius電泳 2、顯微電泳 3、等電點(diǎn)聚焦電泳技術(shù) 4、等速電泳技術(shù) 5、密度梯度電泳 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第四頁，共三十九頁。DNA電泳德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第五頁，共三十九頁。DNA分子帶負(fù)電，向正電方向游泳德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第六頁，共三十九頁。（一）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)

3、在堿性緩沖液中DNA分子帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型瓊脂糖凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第七頁，共三十九頁。瓊脂糖Agarose瓊脂糖為鏈狀多糖 繩狀瓊脂糖束大網(wǎng)孔型Melting at 85 and solidify

4、ing from 32-40 D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose. 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第八頁，共三十九頁。不同濃度瓊脂糖分離DNA分子的范圍瓊脂糖濃度（%） 分離范圍（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第九頁，共三十九頁。瓊脂糖濃度（%） 分離范圍（kb） 0.5 1.0 30 0.7 0.8 12 1.0 0.5 10 1.2 0.4 7 1.5 0.2 3 2.0 0.052德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十頁，共三十九

5、頁。質(zhì)粒DNA分子有三種構(gòu)型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，這三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的泳動率不同，因此電泳后呈三條帶，CCCDNA泳動最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNAEB：即溴化乙錠，它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng 的DNA注意：EB是一種誘變劑，操作時一定要注意安全，必須戴塑料或乳膠手套CCCDNALDNAOCDNA電泳方向德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十一頁，共三十九頁。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型1當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形

6、結(jié)構(gòu)時，稱之為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；2如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型；3若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA），通稱L構(gòu)型。德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十二頁，共三十九頁。瓊脂糖凝膠中DNA的觀察溴化乙錠（EB）DNA：紫外光下 紅色熒光德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十三頁，共三十九頁。瓊脂糖凝膠電泳主要實(shí)驗(yàn)器材電泳儀電泳槽緩沖液瓊脂糖凝膠槽梳子取液器溴酚藍(lán)德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十四頁，共三十九頁。電泳槽結(jié)構(gòu)德厚行遠(yuǎn)，因爾成道

7、第十五頁，共三十九頁。操作步驟瓊脂糖凝膠的制備：溶化，冷卻，EB凝膠板的制備：加梳子，倒膠樣品的制備：樣品+1/5體積溴酚藍(lán)加樣：加樣端為負(fù)極（黑）電泳：5V/cm觀察：紫外燈下觀察，照相德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十六頁，共三十九頁。溶 膠德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十七頁，共三十九頁。準(zhǔn)備膠槽德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十八頁，共三十九頁。凝膠冷卻至50C，加EB至終濃度0.5g/ml德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第十九頁，共三十九頁。鋪 膠德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十頁，共三十九頁。凝膠凝固后取出梳子德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十一頁，共三十九頁。加緩沖液德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十二頁，共三十九頁。準(zhǔn)備樣品德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十三頁

8、，共三十九頁。點(diǎn) 樣德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十四頁，共三十九頁。電 泳德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十五頁，共三十九頁。注意觀察溴酚藍(lán)染液的遷移德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十六頁，共三十九頁。紫外燈下觀察電泳結(jié)果德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十七頁，共三十九頁。照 相德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十八頁，共三十九頁。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑TEMED的作用下聚合而成可以分離小片段（5500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用：蛋白質(zhì)分子的分離鑒定蛋白質(zhì)分子量的測定核酸的分析核酸序列測定德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第二十九頁，共三十九頁

9、。德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十頁，共三十九頁。 迷你垂直型電泳槽德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十一頁，共三十九頁。DNA序列分析電泳槽德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十二頁，共三十九頁。中型雙垂直電泳槽德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十三頁，共三十九頁。蛋白電泳德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十四頁，共三十九頁。（三）醋酸纖維素薄膜電泳 醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因?yàn)槟さ挠H水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5g的蛋白質(zhì)可得到滿意的

10、分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十五頁，共三十九頁。（四）等電聚焦電泳技術(shù) 等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。 現(xiàn)在它經(jīng)常與SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳構(gòu)成二維電泳中的第一向，主要用于分離蛋白質(zhì)。德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十六頁，共三十九頁。IEF的基本原理 在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動，直至某一pH位點(diǎn)時失去電荷而停止移動，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。 德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十七頁，共三十九頁。德厚行遠(yuǎn)，因爾成道第三十八頁，共三十九頁。（五）SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白分