12個分子生物學(xué)常見實驗操作規(guī)程

1、12個分子生物學(xué)常見實驗操作規(guī)程 27/2712個分子生物學(xué)常見實驗操作規(guī)程目錄 TOC o 1-1 h z u HYPERLINK l _Toc113267592 培養(yǎng)細(xì)胞、組織塊RNA 提取操作規(guī)程 PAGEREF _Toc113267592 h 2 HYPERLINK l _Toc113267593 香蕉果實RNA的提取 PAGEREF _Toc113267593 h 5 HYPERLINK l _Toc113267594 芯片清洗 PAGEREF _Toc113267594 h 7 HYPERLINK l _Toc113267595 芯片預(yù)處理 PAGEREF _Toc11326759

2、5 h 8 HYPERLINK l _Toc113267596 雜交 PAGEREF _Toc113267596 h 10 HYPERLINK l _Toc113267597 cDNA芯片雜交 PAGEREF _Toc113267597 h 12 HYPERLINK l _Toc113267598 cRNA熒光標(biāo)記方法 PAGEREF _Toc113267598 h 14 HYPERLINK l _Toc113267599 RNA純化 PAGEREF _Toc113267599 h 19 HYPERLINK l _Toc113267600 RNA反轉(zhuǎn)錄直接標(biāo)記熒光 PAGEREF _Toc11

3、3267600 h 19 HYPERLINK l _Toc113267601 RNA樣品的熒光標(biāo)記（SPA方法） PAGEREF _Toc113267601 h 21 HYPERLINK l _Toc113267602 從全血中提取RNA PAGEREF _Toc113267602 h 25 HYPERLINK l _Toc113267603 單個核細(xì)胞分離方法 PAGEREF _Toc113267603 h 27培養(yǎng)細(xì)胞、組織塊RNA 提取操作規(guī)程一、試劑:1TRizol試劑，Invitrogen 公司產(chǎn)品，北京原平皓生物技術(shù)公司代理，4保存。2. DEPC，Sigma公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生

4、物技術(shù)公司代理。3. MOP，Bocherigmer公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。4. 甲酰胺（Formamide），Sigma公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。5. EDTANa2，氫氧化鈉，NaAc，甲醛，甘油，分析純，國產(chǎn)。6. 溴酚籃（Bromphenol Blue）：Sigma公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。7氯仿、異丙醇，無水乙醇，國產(chǎn)，分裝100ml棕色試劑瓶中寫好標(biāo)簽，為RNA 提取專用，4保存。二、試劑配制：1DEPC 水的處理：用量筒量取去離子水2L，在通風(fēng)櫥中，加入2ml DEPC到2升去離子水中，終濃度為0.1的DEPC。迅速蓋上蓋子，混勻，然后放在搖

5、床中中速搖蕩至少4hr，再高壓滅菌。滅菌時將瓶蓋松開，15磅滅菌20分鐘。275%的乙醇：配制100ml，用100ml量筒量取無水乙醇75ml，加滅菌過的DEPC水定容至100ml，再裝入RNA專用的試劑瓶中，寫好標(biāo)簽，4保存。310 X FA Buffer：配制500ml，稱取6.8g NaAC.3H2O放入1000ml燒杯中，加入400ml DEPC 處理過的去離子水，加入攪拌子，放在磁力攪拌器上溶解。然后加入20.9g MOPs，放在磁力攪拌器上溶解。再加1.86g EDTA二水二鈉，放在磁力攪拌器上溶解。用1M滅過菌的NaOH 調(diào)PH至7.0（約用NaOH 40ml），用DEPC 處理

6、過的去離子水定容至500ml，裝入棕色瓶中，寫好標(biāo)簽，包括：溶液名稱、配制日期和配制人。室溫避光保存。45 x 甲醛變性膠加樣緩沖液（5x loading buffer）: 配制10ml，預(yù)先配制水飽和的溴酚藍(lán)溶液，在1.5ml 離心管中加入約0.1mg溴酚藍(lán)，加入1ml DEPC水溶解，充分振蕩溶解，離心，可見離心管底部有溴酚藍(lán)粉末剩余，上層液體即水飽和的溴酚藍(lán)液。在15ml一次性滅菌離心管中，依次加入以下各種成分：4.0ml 10 x FA buffer3.84ml 甲酰胺2.0ml 100%的甘油720l 37的甲醛80l 0.5M的 EDTA （PH 8.0）16l 水飽和的溴酚藍(lán)10

7、0l DEPC水混勻，分裝，20保存，常用放4保存。5. RNA變性膠：稱取0.4g瓊脂糖，放入RNA制膠專用的150ml三角燒瓶中，加入28ml 1X FA buffer，搖勻，微波爐中加熱融化，中高火加熱12分鐘至沸騰，從微波爐中取出，用力混勻，肉眼觀察無顆粒狀懸浮物。冷卻至約5060，再加入600ul甲醛，搖勻，倒入RNA 專用的制膠器中，RNA制膠器大小為7.5 X 5.5cm，用醫(yī)用膠布將制膠器二端封閉，插入梳子，梳子的選擇根據(jù)實驗的需要，有寬窄和薄厚之分。室溫放置約30min后即可使用。 三、耗材 1. 不同規(guī)格的試劑瓶、燒杯、量筒、滴管、1.5ml離心管。 2. 研缽、勻漿器、勺

8、子、鑷子、液氮。四、儀器設(shè)備 1. 離心機(jī)：型號5810R，Eppendorf產(chǎn)品，德國。 2. 凝膠成像分析儀：型號GDS-7600,UVP產(chǎn)品，美國。 3. 紫外分光光度計DU640，Bakeman公司產(chǎn)品，美國。 4. 水浴鍋5. 天平6. 超靜工作臺五、提取方法（一）組織塊1 準(zhǔn)備研缽、勻漿器、勺子、剪刀、鑷子、液氮，提取RNA的必須器材和試劑。2 研缽預(yù)冷：往研缽內(nèi)反復(fù)加入液氮，至少45次，使研缽充分預(yù)冷。3 帶上手套，口罩，迅速從液氮罐中用鑷子取出樣本,在分析天平中稱重，一次提取的組織塊重量在0.3-0.5g之間。組織塊放入用液氮預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，邊研磨邊加液氮，整個過程都不要

9、使組織塊融化。4 粗研磨后，在超凈工作臺中，用小勺迅速將研碎的組織移入裝有TRizol試劑的勻漿器中, 按100mg組織加入1ml TRIZOL，勻漿至肉眼看不到組織樣本顆粒為止。5. 用滴管將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml 離心管中，每管放入約1ml，室溫放置15min以上，若不馬上進(jìn)行提取，可放入80冰箱中凍存。下接第6步。 注意：研磨、勻漿過程中使用過的器具放入84消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗滌靈洗刷，消毒、烘烤。 （二）貼壁細(xì)胞鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，生長密度超過80以上，可以用于RNA提取。在超凈臺中棄去培養(yǎng)液，加入TRIZOL試劑，TRIZOL加入量基于培養(yǎng)瓶的面積 （1ml/10cm

10、2），不從細(xì)胞數(shù)量考慮。用滴管吹打瓶壁幾次，平放培養(yǎng)瓶，使TRizol 與細(xì)胞充分作用15min以上，用滴管轉(zhuǎn)移1ml 液體到1.5ml 離心管中。若不馬上進(jìn)行提取，可放入80冰箱中凍存。下接第6步。（三）懸浮細(xì)胞鏡下觀察細(xì)胞分布密集，生長狀態(tài)良好，在超凈臺中用移液管轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，室溫，800rpm離心5min。超凈臺中棄去培養(yǎng)液，加入5ml 1xPBS洗一下（去胰酶），棄去1xPBS，加入23ml TRizol試劑，用移液管輕吹打幾次，超凈臺中室溫放置15min以上，轉(zhuǎn)移到1.5ml 離心管中。6按0.2ml 氯仿/ 1ml TRizol的比例加入氯仿， vortex 30sec或

11、用手劇烈搖動15sec，室溫放置23min，然后4，12000rpm 離心15min。7. 離心后溶液分層，分成底層酚氯仿、中間層和上層水相。RNA僅存在水相中，用加樣器將上清轉(zhuǎn)移到另一新的1.5ml 離心管中，不要吸取中間層。按0.5ml 異丙醇/ 1ml TRizol的比例加入異丙醇，混勻，室溫放置10min以上， 12000 rpm 4 離心15min。8. 棄去上清，異丙醇不要回流過多，可再短暫離心，用加樣器將剩余的異丙醇吸出。加入1ml 75乙醇，vortex， 7500 rpm 4 離心5min。9. 棄去75乙醇，通風(fēng)櫥中自然干燥1530min，不要真空離心干燥， RNA不要完全

12、干透，以防不能完全溶解，用DEPC水溶解RNA，每管溶于3050ul，6065助溶510min。三、RNA質(zhì)量檢查1RNA定量，吸取1l的RNA樣品，加入49l DEPC水中，用加樣器上下吹燈混勻，稀釋50倍。用紫外分光光度計DU640測量OD值，用溶解RNA 的DEPC水標(biāo)記空白，吸取50l加入比色杯中。2每測完一個樣品，比色杯要用盛放滅菌去離子水的洗瓶反復(fù)沖洗三次，并用濾紙吸干比色杯表面的水份，用擦鏡紙將表面的塵埃擦凈。再進(jìn)行下一個樣品的測試。3記錄260、280的掃描數(shù)值，OD260吸收值在0.11之間，讀值準(zhǔn)確。若讀值不在0.11之間，需要重新稀釋樣品。計算出OD260/OD280比值

13、，RNA濃度。 RNA濃度OD260 X 40ug/ml X稀釋倍數(shù)4. RNA電泳檢查，取約0.5ugRNA樣品走電泳，加入0.2ml的小管中，補(bǔ)水至8l，加入2l 5 x loading buffer混勻。樣品濃度過高，要進(jìn)行稀釋。70加熱變10mim，然后冰上驟冷，加入稀釋50倍的EB1l，離心后上樣。5電泳需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，電泳槽為RNA專用，千萬不要混用，以防RNA降解，每次電泳時都要加入一個參照樣本Marker RNA，電泳量為0.5g。電泳槽中加入新鮮配制的1x FA buffer電泳液約100ml ，電壓80V，走約30min，電泳過程中要混勻幾次電泳液。6電泳結(jié)束后，凝膠成像

14、儀照像，打印照片，樣品寫好標(biāo)簽，80保存，做好記錄。四、RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)取0.5gRNA走瓊脂糖凝膠電泳，有清晰的28S、18S條帶，無降解，且肉眼觀察28S條帶亮度約是18S的12倍。RNA樣品OD 260/280應(yīng)在1.7-2.1之間。電泳檢查符合標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行RNA純化，再作標(biāo)記。組織總RNA提?。═RIzol來自Gibco公司）1)將50100mg組織于液氮中磨碎，轉(zhuǎn)移至1.5mleppendoff管中。2）將1mlTRIzol試劑加入以上磨碎的組織中，充分勻漿，12,000g，28離心10min，將上清轉(zhuǎn)移。3）于1530放置5min。4）每毫升TRIzol試劑中加入0.2ml氯仿，然

15、后把蓋好的eppendoff管在手中劇烈搖晃。5）于1530放置23min。6）10,000g，2-8離心15min。7）轉(zhuǎn)移上層水相到新的eppendoff管中。8）加入0.25ml異丙醇，0.25ml高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉，1.2MNaCL）,輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，1530放置10min。9）10,000g，2-8離心10min。10)去上清，75%乙醇，1ml,渦旋混勻，7,500g，28離心5min。11）去上清，勿觸及沉淀，空氣中自然晾干，加入50lSDW溶解RNA。香蕉果實RNA的提取一、試劑 1. 十水合硼酸鈉，分子量mw381.4。Sigma生產(chǎn)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。 2.

16、 乙二醇雙（2氨基乙基）四乙酸（EGTA），分子量380.4。Sigma生產(chǎn)，北京鼎國生物技術(shù)公司代理。 3. 二巰基蘇糖醇（DTT），分子量154.2，Genview分裝，北京鼎國生物技術(shù)公司代理。 4. 脫氧膽酸鈉（Sodium Dexycholate），分子量414.56，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。 5. PVP40，分子量40。Amresco生產(chǎn)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。 6. Nonidet P40，F(xiàn)luka分裝，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。 7. 氯化鋰（Lithum Chloride）分子量42.39，Amresco分裝，上海生工代理。 8. 三羥甲基氨基甲烷（Tris）

17、，分子量121.1。Amresco生產(chǎn)，上海吉泰科技有限公司代理。 9. 十二烷基磺酸鈉（SDS），sigma生產(chǎn)，舒伯偉化工儀器有限公司代理。 10. 乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTANa2），分析純天津化學(xué)試劑三廠韋斯實驗用品公司代理。 11. 醋酸鉀（KAC），分子量98.14，無水乙醇，分析純，北京化工廠生產(chǎn)。 12. 蛋白酶K，100mg/瓶，Merck生產(chǎn)，北京鼎國生物技術(shù)公司代理。 二、配制試劑 1. RNA 提取緩沖液： 200mM 十水合硼酸鈉、30mM EGTA、1SDS、10mMDTT、1脫氧膽酸鈉、2PVP40、0.5%NP-40。 2. 0.1M Tris-HCL（pH

18、7.5） 稱取1.2gTris堿，加入80ml RNasefree水，用濃鹽酸調(diào)pH 達(dá)到7.5。 3. 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)稱取18.61g EDTA-Na2H2O，加入80ml RNasefree水和2.0g左右的固體NaOH,放在磁力攪拌器上攪拌至固體完全溶解后，用NaOH溶液將pH值準(zhǔn)確調(diào)整8.0。用RNasefree水定容到100ml。 4. 1M DTT 稱取1.54g DTT，溶解于10ml 0.01M pH5.2NaAc，過濾除菌分裝，貯存于20。 5. 600mmol/L KAc(pH 5.5) 稱取5.89g KAc，溶于30ml RNasefree水

19、中，然后加入2.0ml冰醋酸，調(diào)pH到達(dá)5.5，定容到100ml。 6. 300mM/L EGTA 稱取5.7g EGTA，然后用NaOH顆粒調(diào)節(jié)pH值到達(dá)8.0。 7. 蛋白酶K 配成濃度10mg/ml，往瓶中加入10ml DEPC處理的水，混勻，4保存。 8. 75%的乙醇：配制100ml，用100ml量筒量無水乙醇75ml，加滅菌過的DEPC水定容至100ml，再裝入RNA專用的試劑瓶中，4保存。三、耗材 1. 不同規(guī)格的試劑瓶、燒杯、量筒、滴管。 2. 50ml 離心管、1.5ml離心管。 3. 一次性過濾器，孔徑0.22M、0.45M，20ml注射器。 4. 研缽、勻漿器、勺子、鑷子

20、、液氮。四、儀器設(shè)備 1. 離心機(jī)：型號5810R，Eppendorf產(chǎn)品，德國。 2. 恒溫水浴搖床3. 天平4. 超靜工作臺五、提取方法 1. 稱取2克香蕉果實（果皮：果肉1：1）速凍于液氮中，在研缽中研成粉末。 2. 將RNA提取緩沖液在80溫浴10分鐘。待研缽復(fù)溫，樣品粉末略顯潮濕時，加入10ml RNA 提取緩沖液，勻漿2分鐘。 3. 勻漿液轉(zhuǎn)移到含5mg（10mg/ml）的蛋白酶K的40ml離心管中。 4. 將離心管放在42，100rpm的恒溫水浴搖床溫浴1.5小時，不時混勻。 5. 加入1.1ml 1.6M KCL，并且冰浴1小時。 6. 然后12,000rpm，4離心20分鐘。

21、 7. 上清液轉(zhuǎn)移到注射器內(nèi)，通過一次性過濾器（孔徑0.45M），過濾到一新的50ml離心管中。 8. 加入11ml 4M LiCL，混勻，0沉淀過夜。 9. 12,000rpm，4離心20分鐘。 10. 倒掉上清，沉淀用5ml 2M LiCL洗二次，直到上清相對無色。 11. 將沉淀懸浮于2ml 10mM TrisHcl（pH 7.5）溶液中，將沉淀重懸。 12. 12,000rpm，4離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至另一新管。 13. 加入1ml 600mM KAc（pH 5.5）,冰浴放置15分鐘。 14. 12,000rpm，4離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中。 15. 上清液加入7.

22、5ml 無水乙醇，混勻，20沉淀過夜。 16. 用70預(yù)冷乙醇洗滌沉淀一次，空氣干燥。 17. 溶解于10l DEPC 處理的水中，37助溶5分鐘。說明：本操作中所有器具均用0.1% DEPC 水處理并烘干，所有試劑均用DEPC處理水配制，整個操作過程中要經(jīng)常更換一次性手套，嚴(yán)格防止RNase 的污染。參考文獻(xiàn)Ching-Yi Wanm, Thea A.Wilkins,1994,A Modified Hot Borate Method SignificantlyEnhances the Yield of High-Quality RNA from Cotton(Gossypium hirsut

23、um L.)Analytical.Biochemistry 223,7-12芯片清洗一、試劑1. 檸檬酸三鈉，氯化鈉，醋酸鈉，鹽酸，分析純，國產(chǎn)。2. 十二烷基磺酸鈉（SDS），sigma 公司生產(chǎn)，舒伯偉化工儀器有限公司代理。二、配制試劑 1. 20SSC的配制：在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 2. 10SDS的配制：在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。3. 洗液 = 1 * ROMAN I 2 SSC，

24、0.2% SDS 洗液 = 2 * ROMAN II 0.2 SSC 三、儀器設(shè)備1. 水浴鍋，memert 公司產(chǎn)品，美國。2. 水平搖床，TDK2型，北京通達(dá)科技有限公司制造。3. 離心機(jī)，5810R型離心機(jī)，Eppendorf產(chǎn)品，德國。四、清洗方法1. 將洗液、放在42水浴鍋中預(yù)熱。2. 雜交結(jié)束后，快速將蓋玻片在洗液中去掉，將芯片轉(zhuǎn)移到清洗盒中（盛放洗液），雜交面朝上，放在水平搖床上緩慢清洗。清洗步驟如下： 洗液 = 1 * ROMAN I 2 SSC，0.2% SDS 42 4min 洗液 = 2 * ROMAN II 0.2 SSC 42 4min 3. 芯片清洗后，放在50ml

25、 錐形離心管中，1000rpm離心1分鐘，除去玻片表面的液體，此時的芯片可以進(jìn)行掃描。芯片預(yù)處理PLL基片雜交前預(yù)處理一、試劑琥珀酸酐（Succinc anhydride），分析純，國產(chǎn)。N甲基吡咯烷酮(1-methyl-2-pyrrolidinone)，分析純，國產(chǎn)。3. 硼酸、氫氧化鈉，95乙醇，分析純，國產(chǎn)。二、配制試劑 1. 0.2M硼酸鈉（PH8.0）1000ml，稱取12.36克硼酸，溶于800ml超純水中，用10M NaOH 調(diào)節(jié)pH至8.0，定容體積至1000ml，室溫保存。 2. 封閉劑的配制：稱取8g琥珀酸酐溶于500ml N甲基吡咯烷酮中，玻璃棒攪拌至完全溶解。再往該溶液

26、中緩慢加入35ml 0.2M 硼酸鈉，充分混勻后，倒入棕色玻璃容器中4保存。三、儀器設(shè)備1. 紫外交聯(lián)儀，型號GS Gene Linker UV chamber， BIORAD公司產(chǎn)品，美國。2. 水浴鍋，memert 公司產(chǎn)品，美國。3. 水平搖床，TDK2型，北京通達(dá)科技有限公司制造。4. 離心機(jī)，5810R型離心機(jī)，Eppendorf產(chǎn)品，德國。四、芯片的預(yù)處理（PLL基片）將芯片點(diǎn)有DNA一面在60水浴鍋上水合10S，芯片距水面距離為2-3cm，在空氣中室溫自然干燥，將點(diǎn)有DNA樣品的一面朝上，放在紫外交聯(lián)儀中250mJ 交聯(lián)。把芯片插入銅制的玻片架子上（點(diǎn)有DNA的一面朝向），須用皮

27、筋將芯片兩端固定后，完全浸入到封閉劑中，放在搖床上緩慢搖晃浸泡15分鐘（一次可封閉8張芯片需要250ml 封閉液）?？焖侔研酒D(zhuǎn)入95100高純水中，水的狀態(tài)不要沸騰，來回浸泡2 分鐘。然后轉(zhuǎn)入95冰冷的乙醇中驟冷1分鐘。4. 把芯片放在50ml 錐形離心管中，2000rpm/min 離心1 分鐘，以去除芯片表面的液體，此時的芯片即可用于雜交。氨基基片雜交前預(yù)處理一、試劑 1. 十二烷基磺酸鈉（SDS），sigma 公司生產(chǎn)，舒伯偉化工儀器有限公司代理。2. 無水乙醇，分析純，國產(chǎn)。3. 蒸餾水，國產(chǎn)。二、配制試劑 1. 10SDS的配制，在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助

28、溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。三、儀器設(shè)備 1. 紫外交聯(lián)儀，型號GS Gene Linker UV chamber， BIORAD公司產(chǎn)品，美國。2. 水浴鍋，memert 公司產(chǎn)品，美國。3. 水平搖床，TDK2型，北京通達(dá)科技有限公司制造。4. 離心機(jī)，5810R型離心機(jī)，Eppendorf產(chǎn)品，德國。四、芯片的預(yù)處理（氨基基片） 1. 將芯片點(diǎn)有DNA 的一面在60水浴鍋上水合10S，芯片距水面距離為2-3cm，在空氣中室溫自然干燥，再進(jìn)行一次水合。2. 將點(diǎn)有DNA樣品的一面朝上，放在紫外交聯(lián)儀中250mJ 交聯(lián)。3. 將芯片放在42預(yù)熱 0.

29、5SDS清洗10分鐘，水平搖床80rpm晃動。4. 將芯片放在42預(yù)熱蒸餾水中清洗45分鐘，水平搖床80rpm晃動。5. 將芯片放在乙醇中清洗45分鐘，水平搖床80rpm晃動。6. 把芯片放在50ml 錐形離心管中，2000rpm/min 離心1 分鐘，以去除芯片表面的液體，此時的芯片即可用于雜交。雜交Oligo芯片（包括：Human、Mouse、Rat） 一、試劑1. 檸檬酸三鈉，氯化鈉，醋酸鈉，分析純，國產(chǎn)。2. 十二烷基磺酸鈉（SDS），sigma 公司生產(chǎn)，舒伯偉化工儀器有限公司代理。3. 甲酰胺（Formamide），Sigma公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。4. 50 X D

30、enharts，國產(chǎn)，北京鼎國生物技術(shù)公司。二、配制試劑 1. 20SSC的配制：在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 2. 10SDS的配制：在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。3. 1X雜交液：3XSSC，0.2%SDS，25甲酰胺，5XDenharts。三、儀器設(shè)備1. 蓋玻片，22X22mm 、24X60mm，24X50mm ，Sigma公司產(chǎn)品，室溫保存。2. 雜交盒，自制。3. 水浴鍋，memert

31、公司產(chǎn)品，美國。4. Eppendorf Mini Spin 臺式離心機(jī)，德國。四、雜交 1. 雜交條件的選擇（參考）芯片種類蓋玻片大小雜交體積SPA標(biāo)記方法需要的熒光摻入量cRNA標(biāo)記方法需要的熒光摻入量Human Oligo24x60mm35l200pmol80pmolMouse Oligo24x50mm30l200pmol70pmolRat Oligo24x50mm30l200pmol70pmol2. 以雜交面積2460mm，雜交體積35l為例，配制雜交液。吸取16.8l 滅菌去離子水、8.75l甲酰胺溶解一管標(biāo)記物，短暫離心。將溶解液轉(zhuǎn)移到另一管標(biāo)記物中溶解，短暫離心。將溶液轉(zhuǎn)移到0.

32、2mlEpendorf管中，加入20 X SSC 5.25l，10% SDS 0.7l, 50 X Denharts 3.5l，混勻后離心。95熱變性3分鐘，冰浴驟冷，有SDS析出，待其在室溫中溶解，用于雜交。3. 雜交操作過程a. 將蓋玻片縱向放在實驗臺上，將雜交液輕輕地鋪在蓋玻片中央且自上而下呈一條線。將點(diǎn)有DNA一面壓在雜交液上，確保雜交液覆蓋全部點(diǎn)陣，并避免氣泡產(chǎn)生?？焖侔研酒湃腚s交盒內(nèi)（雜交盒內(nèi)的凹槽內(nèi)預(yù)先加入150l蒸餾水），蓋緊雜交盒蓋，放入42水浴中，雜交1214小時。Oligo分類芯片（多點(diǎn)陣圍欄芯片） 一、試劑1. 檸檬酸三鈉，氯化鈉，醋酸鈉，分析純，國產(chǎn)。2. 十二烷基

33、磺酸鈉（SDS），sigma 公司生產(chǎn)，舒伯偉化工儀器有限公司代理。3. 甲酰胺（Formamide），Sigma公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。4. 50 X Denharts，國產(chǎn)，北京鼎國生物技術(shù)公司。二、配制試劑 1. 20SSC的配制：在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 2. 10SDS的配制：在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。3. 1X雜交液：3XSSC，0.2%SDS，25甲酰胺，5 X

34、Denharts。三、儀器設(shè)備1. 圍欄，蓋玻片，雜交盒，自制。2. 水浴鍋，memert 公司產(chǎn)品，美國。3. Eppendorf Mini Spin 臺式離心機(jī)，德國。四、雜交1. 雜交條件的選擇（參考）芯片種類蓋玻片大小雜交體積直接標(biāo)記需要的熒光摻入量分類芯片7X7 mm12l12pmol2. 雜交面積7X 7mm，雜交體積為12l。用3.6l滅菌去離子水、3l甲酰胺溶解一管標(biāo)記物，短暫離心。將溶解液轉(zhuǎn)移到另一管標(biāo)記物中溶解，短暫離心。將溶液轉(zhuǎn)移到0.2mlEpendorf管中，加入20 X SSC 1.8l，1% SDS 2.4l, 50 X Denharts 1.2l，混勻后離心。9

35、5熱變性3分鐘，冰浴驟冷，有SDS析出，待其在室溫中溶解，用于雜交。3. 雜交操作過程a. 貼圍欄：將圍欄不干膠面貼紙揭掉，用鑷子夾住圍欄放在盛放圍欄的模具中，有粘性的一面朝上。將芯片前端頂在模具的內(nèi)側(cè)，手持芯片Barcode一端緩慢往下壓，使芯片與圍欄貼緊。注意：芯片點(diǎn)有樣品的一面向下。b. 然后把貼好圍欄的芯片放入雜交盒內(nèi)，點(diǎn)有基因的一面朝上。將帶有凸塊的蓋玻片卡放在芯片的黑色圍欄上，注意有凸塊的一面對著芯片；然后從蓋片的小孔用pipette緩慢注入12ul的雜交液后，雜交液會憑借表面張力在蓋玻片下面的凸面和芯片之間形成一道液膜。不要震動蓋玻片或芯片以避免破壞液膜?？焖侔研酒湃腚s交盒內(nèi)（

36、雜交盒內(nèi)的凹槽內(nèi)預(yù)先加入150l蒸餾水），蓋緊雜交盒蓋，放入42水浴中，雜交1214小時。cDNA芯片雜交 一、試劑1. 檸檬酸三鈉，氯化鈉，醋酸鈉，分析純，國產(chǎn)。2. 十二烷基磺酸鈉（SDS），sigma 公司生產(chǎn)，舒伯偉化工儀器有限公司代理。3. 甲酰胺（Formamide），Sigma公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。4. 4 X Hybridization buffer，amershem pharmacia公司產(chǎn)品，北京聯(lián)星生物公司代理。二、配制試劑 1. 20SSC的配制：在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴HCL溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容

37、至1L，分裝后高壓滅菌。 2. 10SDS的配制：在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。3. 1X雜交液：1 X Hybridization buffer，50甲酰胺。三、儀器設(shè)備1. 蓋玻片，22X22mm 、24X60mm，24X50mm ，Sigma公司產(chǎn)品，室溫保存。2. 雜交盒，自制。3. 水浴鍋，memert 公司產(chǎn)品，美國。4. Eppendorf Mini Spin 臺式離心機(jī)，德國。四、雜交 1. 雜交條件的選擇(參考)芯片種類蓋玻片大小雜交體積熒光摻入量HBV cDNA22x2215l40

38、pmolHuman cDNA24x60mm35l100pmol2. 以雜交面積2460mm，雜交體積35l為例，配制雜交液。吸取8.75l 滅菌去離子水溶解一管標(biāo)記物，短暫離心。將溶解液轉(zhuǎn)移到另一管標(biāo)記物中溶解，短暫離心。將溶液轉(zhuǎn)移到0.2mlEpendorf管中，加入17.5l甲酰胺，8.75l 4 X Hybridization buffer，混勻后離心。95熱變性3分鐘，冰浴驟冷，有SDS析出，待其在室溫溶解，用于雜交。3. 雜交操作過程a. 將蓋玻片縱向放在實驗臺上，將雜交液輕輕地鋪在蓋玻片中央且自上而下呈一條線。將點(diǎn)有DNA一面壓在雜交液上，確保雜交液覆蓋全部點(diǎn)陣，并避免氣泡產(chǎn)生?？?/p>

39、速把芯片放入雜交盒內(nèi)（雜交盒內(nèi)的凹槽內(nèi)預(yù)先加入150l蒸餾水），蓋緊雜交盒蓋，放入42水浴中，雜交1214小時。cRNA熒光標(biāo)記方法一、試劑1. cDNA Synthesis Kit ，寶生物工程（大連）有限公司。2. Taq DNA Polymerase，5u/l，寶生物工程（大連）有限公司。3. Random Primer（9mer），上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。4. Klenow Fragment 酶，4u/l寶生物工程（大連）有限公司。5. T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System，Promega 公司產(chǎn)品Cat:P13

40、20。6. RNA Markers, Promega 公司產(chǎn)品,Cat：G319A。7. 熒光染料Cy5-dCTP，Cy3-dCTP，Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。8. T7Oligo（dT）15引物，5-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3（V可以是G、C和A）, 上海博亞生物技術(shù)有限公司合成；9. dNTP，10mMeach，上海博亞生物技術(shù)有限公司。10. QIAquick PCR purification Kit, Qiagen公司產(chǎn)品，北京基因公司代理。11. RNeasy Mi

41、ni Kit，Qiagen公司產(chǎn)品，北京基因公司代理。12. 反轉(zhuǎn)錄終止液（35mM EDTA（pH8.0）、1.4N NaOH）配制1.4ml： 取0.5M EDTA（pH8.0）100l，10N NaOH 200l，加滅菌去離子水1100l至1.5ml離心管中，4保存。1310N 乙酸，配制1ml：取冰乙酸（濃度為17.4M）0.574ml，加滅菌去離子水0.426ml至1.5ml離心管中，4保存。14. 雜交控制樣品（內(nèi)標(biāo)），自制。二、配制試劑 1. T7Oligo（dT）15引物，用DEPC處理的水溶解成1g/l。三、儀器設(shè)備1. PCR儀，PTC-225，美國MJ Research產(chǎn)

42、品。2. Eppendorf Mini Spin 臺式離心機(jī)。德國。3. 紫外分光光度計DU 640，美國Beckman 公司產(chǎn)品。五、實驗方法1. 第一鏈cDNA 合成 于 0.2ml EP離心管中加入以下試劑，總體積20l；對照組（Cy5） 實驗組（Cy3）total RNA 5g5gT7Oligo（dT）15引物2l2l104、125、127（內(nèi)標(biāo)）（稀釋10倍） 65，5分鐘，室溫 10分鐘1l（Cy5） 1l（Cy3）5 1st strand buffer4l4ldNTP Mix (10mM)2l2lRNasin (20u/l)2l2lRtase1l1l加DEPC H2O 至20l2

43、0l混勻，離心。移置42 反應(yīng)1小時，冰浴2分鐘。2. 第二鏈cDNA合成a.在上述反應(yīng)管中再加入以下試劑，總體積80l； 對照組（Cy5）實驗組（Cy3）5 X 2nd Synthesis buffer16l16lDEPC-H2O41l41lE.coli DNA Polymerase （20u/l）1.5l1.5lE.coli RNase H/E.coli DNA Ligase 1.5l1.5l 總體積 80l 80lb.混勻后離心。12反應(yīng)1小時，22反應(yīng)1小時，于70加熱10分鐘后冷卻至室溫；c.加入3.5l T4 DNA Polymerase混勻，離心。37反應(yīng)10分鐘，移置7010分

44、鐘；d.用Qiagen公司PCR純化柱過柱純化。洗脫液約60l 0.5X EB buffer；e.樣品無需測OD260nm、OD280nm，取出下一步反應(yīng)需要的樣品量（約1/2的量），其余4保存。3. 體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA使用Promega公司的T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System于0.2ml EP離心管中加入以下試劑，總體積100l； 對照組（Cy5） 實驗組（cy3）2nd cDNA 取1/2體積2nd cDNA,抽干體積至8l。 取1/2體積2nd cDNA，抽干體積至8l。 2 X buffer 10l 10l Enz

45、yme Mix2l 2l加H2O 至 20l 20l 混勻，離心；反應(yīng)條件為：37反應(yīng)5小時。用Qiagen公司RNeasy Mini Kit純化柱過柱純化，洗脫液約60l water；d. 取純化后產(chǎn)物直接測OD260、OD280，并計算轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量。e. 取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 0.5ug走1.4% 變性RNA瓊脂糖凝膠電泳，電泳時取0.5ul RNA Markers, 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物片段應(yīng)在800bp 左右的一片smear帶。如下圖：4. 反轉(zhuǎn)錄 A. cRNA產(chǎn)物做反轉(zhuǎn)錄熒光標(biāo)記（用于cDNA芯片雜交）a. 于0.2ml EP離心管中加入以下試劑 對照組（Cy5） 實驗組（cy3）cRNA產(chǎn)物2g2g

46、random primer（9mer，1g/l）4l 4l 加H2O 至 6.5l 6.5l 65 5min，室溫10min5SS buffer4l4l0.1M DTT2l2ldNTP(10mMdAGT,1mMdCTP)1l1lCy3/Cy5dCTP1l1lSS 酶 200u/l1.5 l1.5 l混勻，離心；b. 反應(yīng)條件為：42 1hour 7010minc. 中止反應(yīng)：5l反應(yīng)中止液 65 10min，1l 10N乙酸中和，純化定量。d. 用Qiagen公司RCR Kit純化柱過柱純化. 取純化后產(chǎn)物直接測OD260、OD280、OD550、OD650，并計算熒光摻入量。所得產(chǎn)物約40p

47、om用于雜交。B. cRNA產(chǎn)物做反轉(zhuǎn)錄后KLENOW熒光標(biāo)記(用于Oligo芯片) a. 于0.2ml EP離心管中加入以下試劑 對照組（Cy5） 實驗組（cy3）cRNA產(chǎn)物2g2grandom primer（9mer，1g/l）4l 4l 加H2O 至 7.5l 7.5l 65 5min，室溫10min5SS buffer4l4l0.1M DTT2l2ldNTP(10mM each)1l1lSS 酶 200u/l1.5 l1.5 l 混勻，離心；b. 反應(yīng)條件為：2510min 42 1hour 7010minc. 中止反應(yīng)：5l反應(yīng)中止液 65 10min，1l 10N乙酸中和，純化定

48、量。d. 用Qiagen公司RCR Kit純化柱過柱純化. 取純化后產(chǎn)物直接測OD260、OD280，并計算產(chǎn)物量。e. cRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做KLENOW標(biāo)記： 對照組（Cy5） 實驗組（cy3）cRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1g1grandom primer（9mer，1g/l）4l 4l 加H2O 至 16l 16l 953min，然后冰浴5min。10 X Klenow buffer2.5l2.5ldNTP(1.2mMdAGT,0.6mMdCTP)2.5l2.5lCy3/Cy51l1lExofree Klenow Fragment 4u/l1.2l1.2l加H2O 至25l25lf. 37反應(yīng)1.5

49、小時，705分鐘，冰浴5分鐘；g. 用Qiagen公司PCR純化柱過柱純化，洗脫液約60l EB buffer，測OD260、OD280、OD550和OD650。Cy3在OD550有光吸收，Cy5在OD650有光吸收。Cy3 消光系數(shù)（ex550）150，000 MCy5 消光系數(shù)（ex650）250，000 M 計算Cy3、Cy5的摻入量OD 550 總探針體積（l） EX 550 10 6 total pmol of Cy3 OD 650 總探針體積（l） EX 650 10 6 total pmol of Cy5h. 將純化過并已定量的標(biāo)記樣品，放在真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀中抽干（在抽干過程中要避

50、光），用于雜交。附：Qiagen公司PCR 純化柱純化方法吸取5倍體積的Binding buffer加入到待純化的樣品中， pipetting上下輕輕混勻混合液； 將混合后樣品轉(zhuǎn)移到相對應(yīng)已編號的PCR純化柱上，12000rpm 離心1 分鐘；把收集管中的離心液倒掉，加入500 l Wash buffer 進(jìn)行洗脫，12000rpm離心1.5分鐘，重復(fù)一次；離心空甩2分鐘，徹底除凈Wash buffer溶液；將離心管放入新的相對應(yīng)編號的1.5ml的DNase-Free的收集管中，在離心柱吸附膜中央部位加入30l（65預(yù)熱）Elution buffer 洗脫純化柱。12000rpm離心1.5分鐘

51、。重復(fù)洗脫一次，收集洗脫液測OD值定量。RNA純化一、試劑： 1. RNeasy Mini Kit，Qiagen公司產(chǎn)品，北京基因公司代理。 2. 無水乙醇，分析純，國產(chǎn)。 3. 巰基乙醇，Ameresco公司產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司代理。二、儀器設(shè)備 1. Eppendorf Mini Spin 臺式離心機(jī)。三、純化方法若RNA電泳條帶沒有降解，可使用RNeasy mini spin column 純化。純化柱的RNA最大結(jié)合量為100g。在超凈工作臺中，吸取100g RNA，體積不足100l，取DEPC處理的H2O補(bǔ)足至100l混勻。吸取3.5l -巰基乙醇加入到350l RLT bu

52、ffer中混勻，然后將-巰基乙醇RLT buffer加入到100l RNA樣品中混勻，再加入250l 100乙醇，用加樣器上下混勻，不要vortex和離心，作用1015min。將700l液體轉(zhuǎn)移到純化柱中，在柱中靜止12min，室溫，12000rpm離心15sec。棄去收集管中的液體，向柱中加入500l RPE buffer，室溫，12000rpm離心15sec。棄去收集管中的液體，向柱中加入500l RPE buffer，室溫，12000rpm離心15sec。棄去收集管中的液體，室溫，12000rpm離心1min（空甩）。把純化柱放入另一個新的1.5ml離心管中，加入30l 60預(yù)熱的DEP

53、C水到純化柱上，靜止23min，室溫，12000rpm離心1min。再在純化柱上加入30l 60預(yù)熱的DEPC水，靜止23min，室溫，12000rpm離心1min。10. 洗脫體積約有60l，進(jìn)行RNA質(zhì)量檢查，包括測OD、走電泳。符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA，寫好標(biāo)簽，包括：樣品編號、濃度、純化日期，放入80保存。RNA反轉(zhuǎn)錄直接標(biāo)記熒光 試劑Cy3dCTP，25 nmol，pharmacia產(chǎn)品，北京基因公司代理。20避光保存。 Cy5dCTP，25 nmol，pharmacia產(chǎn)品，北京基因公司代理。20避光保存。100mM dNTP，Promega產(chǎn)品，北京科普佳生物技術(shù)開發(fā)有限公司代理。工作液

54、配制為：10mM each dATP、dGTP、dTTP和1mM dCTP混合物。配制500l，取100mM dATP、dGTP、dTTP各50 l，100mM dCTP 5l至1.5ml RNase-Free的離心管中，加DEPC水345l至終體積500l，20保存。4. Superscript = 2 * ROMAN II反轉(zhuǎn)錄酶，200 u/l，Invitrogen產(chǎn)品，北京科普佳生物技術(shù)開發(fā)有限公司代理。20保存。5. Oligo（dT）15，0.5g/l，promega產(chǎn)品，北京科普佳生物技術(shù)開發(fā)有限公司代理。20保存。 6 反轉(zhuǎn)錄終止液（35mM EDTA（pH8.0）、1.4N

55、NaOH）配制1.4ml： 取0.5M EDTA（pH8.0）100l，10N NaOH 200l，加滅菌去離子水1100l至1.5ml離心管中，4保存。7 10N 乙酸，配制1ml：取冰乙酸（濃度為17.4M）0.574ml，加滅菌去離子水0.426ml至1.5ml離心管中，4保存。二、耗材和儀器設(shè)備1. QIAquick PCR purification Kit, QIAGEN公司，德國。室溫保存。2. 紫外分光光度計，DU 640，Beckman 公司制造，美國。3. PCR儀，PTC-225， MJ Research產(chǎn)品，美國。4. Eppendorf Mini Spin 臺式離心機(jī)，

56、德國。 三、探針標(biāo)記total RNA為模板的探針標(biāo)記 total RNA 20g Oligo (dT)15 2lspike mRNA 1lDEPC處理H2O 至 11l用pipetting上下輕輕混合后，短暫離心混勻。70 C加熱5分鐘，室溫冷卻10 分鐘。短暫離心30Sec，在退火反應(yīng)混合物中加入下列標(biāo)記成份：5 X CyScript buffer 4l0.1M DTT 2ldNTP Nucleotide Mix 1lCy3-dCTP or Cy5-dCTP 1lSuperscript = 2 * ROMAN II reverse transcriptase 1.5l 20 lD. 用pi

57、petting上下輕輕混勻，使熒光物質(zhì)均勻分布在反應(yīng)混合物中后，短暫離心30sec。E將反應(yīng)物放入PCR反應(yīng)頭中，把預(yù)先設(shè)置的反應(yīng)程序打開后，42反應(yīng)1.5小時。 2堿性烈解RNA模板待反應(yīng)結(jié)束后，在離心管中加入5l的反應(yīng)終止液。Vortex后，短暫離心30sec混勻，PCR儀上70加熱5分鐘。堿裂解后，向反應(yīng)物中加入1l 10M乙酸，離心混勻后，立即做反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化。 3. 探針的純化用Qiagen公司PCR 純化柱純化吸取5倍體積的Binding buffer（125l）加入到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中， pipetting上下輕輕混勻混合液。 將混合后樣品轉(zhuǎn)移到相對應(yīng)已編號的PCR純化柱上，12000r

58、pm 離心1 分鐘。把收集管中的離心液倒掉，加入750 l Wash buffer 進(jìn)行洗脫，12000rpm離心1.5分鐘最后離心空甩2分鐘，徹底除凈buffer溶液，以免影響OD值的定量。將離心管放入新的相對應(yīng)編號的1.5ml的DNase-Free的收集管中，在離心柱吸附膜中央部位加入30l（65預(yù)熱） Elution buffer 洗脫純化柱。12000rpm離心1.5分鐘。重復(fù)以上操作，12000rpm離心2分鐘，收集洗脫液共60 l待測OD值定量。 4. 探針定量A用紫外分光光度計測定Cy3、Cy5的光吸收，Cy3在OD 550有吸收，Cy5在OD 650有吸收。Cy3 消光系數(shù)（e

59、x550）150，000 MCy5 消光系數(shù)（ex650）250，000 M將純化后的探針約60 l全部加入100 l 比色杯中，測定OD 550或OD 650光吸收。 計算Cy3、Cy5的摻入量OD 550 X 總探針體積（l）. EX 550 X 10 6 total pmol of Cy3 OD 650 X 總探針體積（l）. EX 650 X 10 6 total pmol of Cy5B. 將純化過并已定量的標(biāo)記樣品，放在真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀中抽干（在抽干過程中要避光）。 RNA樣品的熒光標(biāo)記（SPA方法）一、試劑1. cDNA Synthesis Kit ，寶生物工程（大連）有限公司。2

60、. Taq DNA Polymerase，寶生物工程（大連）有限公司。3. Random Primer（9mer），上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。4. Klenow Fragment 酶，寶生物工程（大連）有限公司。5. 熒光染料Cy5-dCTP，Cy3-dCTP，Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。6. T7Oligo（dT）15引物，5-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3（V可以是G、C和A）, 上海博亞生物技術(shù)有限公司合成；Heel Primer, 5-AAACGACGGCCAGTGAA