華北理工水處理生物學實驗指導07微生物純種分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)

1、實驗七 微生物純種分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)本實驗的對象是水樣或活性污泥中微生物的純種分離和培養(yǎng)。通常，在處理不同水質(zhì)的廢水時，起作用的微生物群和種類也不同。我們除可用顯微鏡直接觀察微生物形態(tài)，大致了解其中的微生物種群外，更重要的還必須研究是哪些種類的微生物對該種廢水起生物氧化作用，其作用原理是什么，產(chǎn)生什么產(chǎn)物等等，以便提高處理效果。此外，有時我們還需從土壤環(huán)境中分離和培養(yǎng)純菌種來處理工業(yè)廢水。因此，為了從事以上這些研究工作，就必須學習微生物純種分離、培養(yǎng)及接種的技術(shù)，進而再學會做微生物生理生化反應(yīng)的實驗，為廢水處理服務(wù)。在給水處理的細菌檢查中，細菌的分離、培養(yǎng)和接種也是一個重要環(huán)節(jié)。微生物純種分

2、離的方法有兩種：稀釋平板法和平板劃線法。在本實驗中仍要學習這兩種方法。一、目的要求 掌握幾種常用的分離純化物的基本操作技術(shù)。二、基本原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個方面：1選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物； 2微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落可以是一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等計數(shù)來完成的。純

3、培養(yǎng)的確定：1確定其菌落觀察特征；2結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征的確定。三、實驗器材1無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)、無菌吸管、無菌錐形瓶、無菌試管、5管無菌水(每管有9mL滅菌過的自來水)。2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(已滅菌的) 、水樣或活性污泥。3接種環(huán)、酒精好(或煤氣燈)、恒溫箱(培養(yǎng)箱)等。以上器材，除水樣或活性污泥、接種環(huán)、恒溫箱外，均在實驗五中準備好。四、操作方法及步驟(一)活性污泥的純種分離與培養(yǎng)1稀釋平板分離(1)取樣(2)稀釋水樣1)將5支裝有9mL無菌水的試管以0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001（或101、102、103、104、105）依次編號。2)以無菌操作，用

4、1mL的無菌吸管吸取1mL樣品于第一管無菌水中，將吸管吸洗3次，搖勻，即為稀釋10倍的菌液。再從此0.1濃度的菌液中吸取1mL于第二管中，將吸管吸洗3次，搖勻，即為稀釋100倍的菌液，以同樣方法，依次類推，分別得到稀釋103倍、104倍及105倍的菌液，所得菌液分別為0.1、0.01、0.001、0.0001及0.00001(即101、102、103、104及105)等濃度。(3)平板的制作I)將無菌培養(yǎng)皿編號為0.1、0.01、0.00001(101、102、105)。2)另取一支lmL的無菌吸管從濃度小的105的菌液開始，依次分別取0.5mL菌液于相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿內(nèi)(每個濃度做3個平板)。

5、每次吸取時，吸管都應(yīng)在菌液中反復吸洗幾次。3)在稀釋菌液的同時，就要將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待融化的培養(yǎng)基冷到40一50C左右(溫度不可過高，否則微生物容易被燙死，溫度過低，培養(yǎng)基容易凝固，平板不平)時，傾注10一15mL入上述盛有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)(每一培養(yǎng)皿內(nèi)應(yīng)加入的培養(yǎng)基量須根據(jù)皿的大小決定，以能使培養(yǎng)皿底部鋪滿培養(yǎng)基而形成厚約23mm的薄層為適當，在直徑為90mm的培養(yǎng)皿內(nèi)注入1015mL，可滿足此要求)，如圖72所示。在傾注前，應(yīng)先將盛有培養(yǎng)基的管子的管口或瓶子的瓶口在火焰上微燒一周。培養(yǎng)基傾入后迅速蓋上皿蓋，培養(yǎng)基傾入后平放桌上，輕輕轉(zhuǎn)動，使培養(yǎng)基和稀釋菌液充分混合均勻，冷卻后，即成

6、平板。將培養(yǎng)皿倒置于30C的恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察有無菌落長出。培養(yǎng)皿所以要倒置是為了防止培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)到皿蓋上而使培養(yǎng)基變干。2平板劃線分離。(1)取樣 同前。(2)制備平板培養(yǎng)基 將融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以無菌操作倒入無菌的空培養(yǎng)皿內(nèi)(操作方法同前，但培養(yǎng)皿內(nèi)末注入菌液)。加蓋，在平桌上轉(zhuǎn)動，凝固后即成所需的平板。(3)劃線 以無菌操作，右手持經(jīng)燒灼滅菌冷卻的接種環(huán)從裝有活性污泥的器皿中取一環(huán)活性污泥。同時左手持培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀起一些，右手把接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿，將一環(huán)活性污泥在平板表面輕輕地劃線(千萬不要戳破培養(yǎng)基平板)

7、，可作平行劃線、扇形劃線，或其它連續(xù)劃線。無論采用那種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。劃線后，將皿蓋蓋好。倒置培養(yǎng)皿于30C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，則平板上即長出菌落。接種環(huán)用過后即再燒灼滅菌。(二)其它一些接種的操作技術(shù)微生物的接種方法，除前面所提到的外，隨著所用的培養(yǎng)基、實驗?zāi)康牡鹊牟煌?，還有好幾種，但是它們的基本操作都是類似的，并且都要嚴格注意無菌操作。1斜面接種技術(shù) 這是將微生物從一個斜面培養(yǎng)基(或平板培養(yǎng)基)上接種到另一個斜面培養(yǎng)基上的方法，見圖810。斜面培養(yǎng)基可用小試管(15mm150mm)制備，每管約裝3一5mL(14一13試管高度)，見圖73。(

8、1)將試管貼上標簽、注明菌名、接種日期等。(2)將培養(yǎng)好的菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管用大拇指和其它4指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分。斜面向上，管口齊平，并使它們位于水平位置。(3)將棉塞用右手擰轉(zhuǎn)松動，以利接種時拔出。(4)右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)燒灼滅菌，環(huán)上凡是在接種時可能進入試管的部分都應(yīng)用火燒灼。(5)在火焰旁，用右手拔掉棉塞。(6)以火焰微燒試管口一周，燒灼時應(yīng)不斷地轉(zhuǎn)動管口，使管口上可能沾污的少量菌或帶菌塵埃得以燒去。(7)將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分(如斜面的頂端)，使其冷卻，以免燙死被接種的菌種。然后輕輕挑取少許菌種，抽出接種環(huán)并迅速將

9、接種環(huán)伸進另一試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃線(由底部向頂部劃線)。(8)接種完后，將接種環(huán)取出，將試管塞好棉塞。2液體接種 這是由斜面培養(yǎng)基(或平板培養(yǎng)基)接種到液體培養(yǎng)基中的方法。(1)操作方法與前同，試管可略向上斜，以免培養(yǎng)基流出。(2)將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時，可使環(huán)在液體表面與管壁接觸的部分輕輕摩擦，接種后，塞上棉塞。將試管在手掌內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動，使菌體在培養(yǎng)基中均勻分散。3由液體培養(yǎng)基接種液體培養(yǎng)基 接種用具常用無菌吸管或無菌滴管。無菌操作注意事項與前同，吸管或滴管要預(yù)先經(jīng)干熱或濕熱法滅菌，不能在火焰上燒灼。具體操作較簡單，只要用無菌吸管或滴管從有菌的試管吸取一定量的培養(yǎng)液到另一管液體培養(yǎng)基中，塞好棉塞即可。4穿刺接種 這是由斜面菌種接種到固體深層培養(yǎng)基的方法。培養(yǎng)基可裝于大試管(20mm220mm)內(nèi)，每管約裝1215mL。(1)如前斜面接種操作，但用接種針(必須很挺直)取出少許菌種。(2)用左手斜握盛有固體深層培養(yǎng)基的試管，用右手將接種針移入培養(yǎng)基，自中心刺入，直到接近管底，但不要穿透。然后沿穿刺途徑緩慢將針拔出。這樣，接種線整齊，易于觀察。將以上分離、接種的培養(yǎng)物置于恒溫箱中在一定溫度下培養(yǎng)一定時間后觀察結(jié)果。接種環(huán)和接