基因工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)(上師大)

1、節(jié)概述一.基因工程概念及特點(diǎn)1.概念2.顯著特點(diǎn)3.基因工程在生物學(xué)研究領(lǐng)域中的地位二.基因工程的誕生及其發(fā)展史1.基因工程產(chǎn)生的基礎(chǔ) （1）理論上的三大發(fā)現(xiàn) 發(fā)現(xiàn)DNA是生物體的遺傳物質(zhì) 明確DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制 遺傳密碼成功破譯、“操縱子學(xué)說”的提出（2）技術(shù)上的三大發(fā)明建立DNA體外切割技術(shù)與連接技術(shù)載體的使用和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)、DNA序列分析、瓊脂糖電泳等技術(shù)的建立2.基因工程的誕生Berg等人：SV40的DNA與DNA組合Cohen等人： TR 質(zhì)粒與KR質(zhì)粒重組轉(zhuǎn)化無抗性大腸桿菌篩選雙抗性菌落(TRKR)3.基因工程的快速發(fā)展（1）利用原核生物成功表

2、達(dá)真核生物基因非洲爪蟾rDNA導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)利用原核細(xì)胞產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子（2）重要生物基因組研究（3）生物技術(shù)其他領(lǐng)域的發(fā)展生物技術(shù)主要研究領(lǐng)域基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程（4）分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展第二節(jié) 基因工程的研究?jī)?nèi)容及其應(yīng)用一.基因工程基本技術(shù)路線及主要研究?jī)?nèi)容1.制備目的基因2.制備載體3.DNA體外重組4.重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞及擴(kuò)增5.篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞6.鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的目的基因7.實(shí)現(xiàn)目的基因的功能表達(dá)二.基因工程的應(yīng)用1.基因工程在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用利用“反向生物學(xué)”方法研究基因功能基因之間相互作用及相互調(diào)控的研究2.基因工程在醫(yī)藥領(lǐng)域中的

3、應(yīng)用（1）基因診斷（2）基因治療（P7）（3）基因制藥第一個(gè)被成功制備的基因工程藥物-人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子第一個(gè)被批準(zhǔn)生產(chǎn)和使用的基因工程藥物-人胰島素利用基因工程生產(chǎn)的藥物種類(主要為蛋白質(zhì)藥物)基因工程藥物生產(chǎn)的四個(gè)不同階段基因工程藥物生產(chǎn)的主要優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)量高安全性好藥用功能強(qiáng)制造新型藥物3.基因工程在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的作用（1）提高糧食作物的產(chǎn)量和品質(zhì)提高作物光合作用效率 創(chuàng)造新的固氮作物提高作物抗逆性獲得營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食用品質(zhì)優(yōu)良的農(nóng)作物（2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)在畜、牧、漁業(yè)中的應(yīng)用（3）基因工程與工業(yè)釀酒工業(yè)食品工業(yè)醫(yī)藥工業(yè)（4）基因工程與環(huán)境保護(hù)環(huán)境檢測(cè)環(huán)境污染凈化第三節(jié) 基因工程的安全性一.基因

4、工程早期的安全性爭(zhēng)論1972-1973年研究初期1975年，16國(guó)會(huì)議1977年后研究成果陸續(xù)誕生第三節(jié) 基因工程的安全性二.基因工程的安全性問題對(duì)人體的安全性對(duì)環(huán)境的安全性三.基因工程技術(shù)應(yīng)用的安全管理例:轉(zhuǎn)基因水稻安全評(píng)價(jià)之一-中間試驗(yàn)第二章 基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)第一節(jié) 基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)一.基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.基因基本結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子（P17）轉(zhuǎn)錄區(qū)終止子啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄區(qū) 終止子基因2.原核生物基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（1）操縱子結(jié)構(gòu)原核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)-35區(qū)和-10區(qū)的作用：Pribnow盒（-10區(qū)） -打開雙螺旋，形成開放型啟動(dòng)子復(fù)合物 -RNA聚合酶定向作用，控制RNA53方向合成-35序列

5、 -RNA聚合酶因子結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄區(qū)起點(diǎn)（+1）5TTGACANNNNNNNNNNNNNNNNNTATAANNNNNN（A/G）NNNNN 33AACTGTNNNNNNNNNNNNNNNNNATATTANNNNN（T/C）NNNNN 5 DNA-35-10區(qū)+1TTGACATATAAA/G（2）原核生物mRNA的特征半衰期短多順反子存在SD序列SD序列的作用：P19啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄區(qū) 終止子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄區(qū)OH-AUUCCUCCACUAG-316SrRNA-AGGAGGU-AUGCGAGCUUUUAGU-mRNA5-10-20-30起點(diǎn)+1AUGmRNA53（3）原核生物基因的終止子特點(diǎn)UUUUGGAGC

6、CUUU高G+CUUUUUAUU3末端mRNA末端CCUCGGAAA轉(zhuǎn)錄終止序列的一般特征反向重復(fù)ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA3553高G+C高A+T反向重復(fù)本征終止子 2.真核生物基因的結(jié)構(gòu)特征（1）啟動(dòng)子特點(diǎn)-25 -30：TATA序列-70 -80：CAAT序列-80 -100：GC序列（2）基因不連續(xù)性（3）內(nèi)含子（4）外顯子（P20）（5）連接區(qū)(5GT-AG3法則)基因啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄區(qū) 終止子AUGUAA5UTR3UTR轉(zhuǎn)錄二.從DNA到蛋白質(zhì)1.基因表達(dá)概念(P22)2.基因表達(dá)過程及調(diào)控以

7、反義鏈為模板轉(zhuǎn)錄合成的RNA鏈按5 3方向生長(zhǎng)（1）原核生物的基因表達(dá)RNA聚合酶組成：2（全酶）、2（核心酶）轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)（2）真核生物的基因表達(dá)由三種RNA聚合酶控制不同RNA轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)基因順式作用元件DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子，反式作用因子）三.基因研究進(jìn)展1. 遺傳密碼與信息流2. 結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因（P27）3. 管家基因和奢侈基因（P27）4.移動(dòng)基因5. 重疊基因6.假基因7.串聯(lián)基因簇8. 基因組（1）原核生物基因組的特點(diǎn)P29（2）真核生物基因組的特點(diǎn)P29第二節(jié) 基因工程的基本技術(shù)一.核酸凝膠電泳1.基本原理 DNA等電點(diǎn)偏酸，當(dāng)處于電泳條件（PH=8）時(shí)，DNA鏈上帶

8、有負(fù)電荷，在電場(chǎng)力的作用下會(huì)向正極泳動(dòng)。在電泳中，長(zhǎng)度及構(gòu)型不同的DNA片段將被分離。 2.凝膠類型3.凝膠分辨力同凝膠類型及濃度的關(guān)系4.溴化乙錠的作用溴酚藍(lán)的作用上樣緩沖液的重要成分及作用二.PCR技術(shù) 1.一般程序（高溫變性、低溫退火、適溫延伸）2.反應(yīng)體系（1）引物（2）TaqDNA聚合酶在棲熱水生菌中分離獲得以單鏈DNA為模板，以引物為起點(diǎn)，按53方向合成新生互補(bǔ)鏈無35外切酶活性最適合成DNA溫度為72 C（3）反應(yīng)緩沖液（4）模板（5）dNTP3.PCR的相關(guān)技術(shù)與應(yīng)用前景（1）全基因克隆及檢測(cè)（2）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）獲得目的基因cDNA序列以mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDN

9、A為模板進(jìn)行PCR（3）錨定PCR技術(shù)獲得目的基因cDNA序列用于在體外擴(kuò)增未知DNA序列的方法（4）基因的體外誘變與突變的檢測(cè)（5）基因組比較研究隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD） 用于研究不同生物的親源關(guān)系PCR法引入酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì):53355-GGGAATTC 引物1CTTAAGGG-5引物253355333 5-GGGAATTCCTTAAGGG-553CTTAAGGG-5引物2 5-GGGAATTC 引物13 5-GGGAATTCCTTAAGGG-53CTTAAGGG-53 3-CCCTTAAG 5-GGGAATTC CTTAAGGG-5GAATTCCC-33 5-GGGAATTC

10、 引入EcoR位點(diǎn)5-GGGAATTCCTTAAGGG-5CTTAAGGG-5 3-CCCTTAAGGAATTCCC-3 5-GGGAATTCCTTAAGGG-5 3-CCCTTAAGGAATTCGG-3 5-GGGAATTCCTTAAGGG-5 3-CCCTTAAGGAATTCGG-3 5-GGGAATTCCTTAAGGG-53 3-CCCTTAAG 5-GGGAATTC CTTAAGGG-5GAATTCCC-33 5-GGGAATTC三.分子雜交1.核酸雜交基本理論DNA變性DNA復(fù)性不同核酸分子雜交（DNA-DNA，DNA-RNA）2.印跡3.核酸探針及標(biāo)記（1）核酸探針概念(P34)（

11、2）探針標(biāo)記物（放射性同位素、非放射性標(biāo)記物）（3）體外標(biāo)記化學(xué)標(biāo)記法或酶促法4.常用分子雜交類型（1） Southern印跡雜交（Southern blotting）概念（P35）應(yīng)用主要操作步驟（2）Northern 印跡雜交（Northern blotting）概念應(yīng)用（3）菌落原位雜交（4）組織原位雜交（5）斑點(diǎn)雜交（6）蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western blotting）概念應(yīng)用第三章 基因操作的工具酶 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶一.寄主控制的限制與修飾作用1.寄主限制與修飾現(xiàn)象的解釋限制性核酸內(nèi)切酶DNA甲基化酶 2.寄主限制與修飾的生物學(xué)作用(P43)3.寄主限制與修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)意義由

12、此發(fā)現(xiàn)了限制性核酸內(nèi)切酶二.限制性核酸內(nèi)切酶的分類與命名1.分類(型、型、型)2.命名屬名+種名+菌株（或型）+ 修飾體系類型三.型限制酶的特性與DNA切割1.識(shí)別序列的主要特點(diǎn)長(zhǎng)度為4-8個(gè)核苷酸在DNA連上呈連續(xù)分布，或間斷分布DNA序列呈回文結(jié)構(gòu)2.切割方式（1）平切（2）錯(cuò)切3.同裂酶與同尾酶（1）同裂酶概念 P46完全同裂酶不完全同裂酶（2）同尾酶概念 P46四.影響限制酶活性因素1.DNA純度（1）雜質(zhì)影響（2）彌補(bǔ)的辦法增加酶用量擴(kuò)大反應(yīng)體系延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間2.DNA甲基化程度3.溫度4.DNA分子結(jié)構(gòu)5.緩沖體系第二節(jié) DNA連接酶類一.兩種DNA連接酶1.大腸桿菌DNA連接酶只連

13、接粘性末端2.T4 DNA連接酶粘性末端和平末端都能連接二.DNA連接酶的連接作用及特點(diǎn)連接3,5磷酸二酯鍵5- POH-3連接酶5- POH-35- POH-3無活性連接酶5- POH-35- POH-3三.連接效率的判斷1.凝膠電泳2.遺傳轉(zhuǎn)化四.影響連接反應(yīng)的因素1.溫度2.連接酶的用量3.連接時(shí)間4.插入片段大小5.插入片段與載體分子之比第三節(jié) DNA聚合酶一.DNA聚合酶種類及主要特性1.大腸桿菌DNA聚合酶2. Klenow聚合酶3.T4DNA聚合酶4.T7DNA聚合酶5.TaqDNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶二.三類DNA聚合酶在基因操作中的重要應(yīng)用1.一般DNA聚合酶：補(bǔ)平DNA、制備

14、DNA探針2. TaqDNA聚合酶：體外合成DNA3.逆轉(zhuǎn)錄酶：合成cDNA 第四節(jié) 修飾酶類一.S1核酸酶功能及應(yīng)用催化單鏈RNA和單鏈DNA分子降解2.降解雙鏈核酸分子內(nèi)的單鏈區(qū)二.堿性磷酸酶主要功能及應(yīng)用異源DNA連接前，除去5磷酸，阻止自身環(huán)化三.T4多核苷酸激酶功能及應(yīng)用添加5缺失的磷酸基團(tuán)四.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶功能及應(yīng)用在DNA鏈末端增加同源互補(bǔ)物第四章 基因克隆的載體基因克隆載體概念：P59基因克隆載體應(yīng)具備的條件：P59第一節(jié) 質(zhì)粒載體一.質(zhì)粒的生物學(xué)特征1.質(zhì)粒DNA多為環(huán)狀雙鏈多具有抗性基因有不同構(gòu)型超螺旋（SC型）、開環(huán)雙螺旋（0C型）、線狀雙螺旋（L型）SC0CL2.

15、質(zhì)粒的分類（1）依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞性質(zhì)分類接合型非接合型（2）依據(jù)是否引起宿主細(xì)胞新性狀分類顯性質(zhì)粒隱性質(zhì)粒（3）依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類嚴(yán)緊型質(zhì)粒：低拷貝數(shù)松弛型質(zhì)粒：高拷貝數(shù)3.質(zhì)粒的不親和性親和性非親和性二.重要大腸桿菌質(zhì)粒載體舉例1.pSC101質(zhì)粒載體 在基因工程研究歷史上的重要性2.ColE1質(zhì)粒載體含有松弛型復(fù)制子 3.pBR322及其衍生的質(zhì)粒載體（1）pBR322質(zhì)粒載體的人工構(gòu)建（2）pBR322質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)分子量小具有較高拷貝數(shù)含有兩種抗生素抗性標(biāo)記基因 插入失活效應(yīng)（3）pBR322質(zhì)粒載體的改良pAT153質(zhì)粒pBR325oriTetRAmpRpBR3224.pUC質(zhì)粒載體（

16、1）四個(gè)組成部分pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)氨卞青霉素抗性基因-半乳糖苷酶多肽基因片段（LacZ）多克隆位點(diǎn)（MCS)IPTG 誘導(dǎo)-半乳糖苷酶表達(dá)X-gal-半乳糖苷酶半乳糖 + 5-溴-4-氯靛藍(lán) 多克隆位點(diǎn)AmpRoriLacZ藍(lán)色化合物 -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)原理：（2）pUC質(zhì)粒載體互補(bǔ)檢測(cè)（3）優(yōu)點(diǎn)分子量小及拷貝數(shù)高適于用組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體含多克隆位點(diǎn)5.TA克隆載體可與PCR產(chǎn)物連接，擴(kuò)增外源DNA的載體。三.理想質(zhì)粒載體構(gòu)建的基本方案1.減少體積2.減少酶切位點(diǎn)3.便于檢測(cè)4.根據(jù)要求改造復(fù)制特性5.質(zhì)粒安全性改造第二節(jié) 噬菌體載體一.噬菌體的一般生物學(xué)特征二.噬菌體載體的構(gòu)建1

17、.噬菌體特性（1）DNA分子(cos位點(diǎn))（2）DNA基因圖（p79）必需基因區(qū)非必需基因區(qū)（3）DNA復(fù)制方式早期復(fù)制：型雙向復(fù)制晚期復(fù)制：滾環(huán)復(fù)制 2.構(gòu)建噬菌體載體的原則（1）切去部分非必需區(qū)（2）在非必需區(qū)制造限制酶切口（3）改變噬菌斑表型特征（4）建立DNA分子體外包裝系統(tǒng)DNA體內(nèi)包裝過程 實(shí)現(xiàn)DNA體外包裝的關(guān)鍵 同時(shí)獲得合成兩種不同外殼蛋白的缺失型噬菌體噬菌體DNA包裝限制 控制在野生型DNA長(zhǎng)度的75%-105%三.噬菌體載體類型1.插入型載體2.替換型載體第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體一.組成pBR322質(zhì)粒噬菌體cos位點(diǎn)二.特性1.具有質(zhì)粒特性高拷貝能力具有抗生素抗性基因產(chǎn)生菌落

18、2.具有噬菌體載體部分特性體外包裝高效轉(zhuǎn)導(dǎo)3.具有高容量的克隆能力三.柯斯載體克隆外源DNA一般操作程序cosAmpR限制酶位點(diǎn)真核生物DNA限制酶消化連接包裝入噬菌體感染選擇轉(zhuǎn)化子第四節(jié) 單鏈DNA噬菌體克隆載體一.M13噬菌體的生物學(xué)特性二.構(gòu)建M13克隆載體的策略和途徑三.M13克隆載體特點(diǎn)及應(yīng)用第五節(jié) 噬菌粒載體一.噬菌粒載體概念(P90)二.pUC118和pUC119噬菌粒載體第六節(jié) 人工染色體克隆載體一.人工染色體克隆載體的含義和特點(diǎn)1.含義2.主要特點(diǎn)能夠克隆外源大片段DNA穿梭載體（P94）二.人工染色體克隆載體類型三.人工染色體克隆載體應(yīng)用1.構(gòu)建基因組文庫2.基因治療3.功

19、能基因鑒定第五章 DNA分子克隆第一節(jié) 重組體的構(gòu)建一.粘末端連接二.平末端直接連接三.平末端修飾后連接1.同聚物加尾法2.加銜接物或接頭連接法3.PCR法引入酶切位點(diǎn)的連接一.重組DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染第二節(jié) 重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞1.概念（P109）2.轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染的主要區(qū)別3.重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的關(guān)鍵 成功制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞4.轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染頻率的確定 P110二.重組體分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)三.直接轉(zhuǎn)化技術(shù)1.電激法2.顯微注射法3.基因槍法第三節(jié) 重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化子（P112）重組子（P112）期望重組子（P112）第三節(jié) 重組體克隆的篩選與鑒定一.表型特征篩選（遺傳檢測(cè)法）1.

20、利用載體提供的表型特征選擇2.利用插入序列提供的表型特征篩選二.菌落（噬菌斑）原位雜交篩選1.原理2.菌落（噬菌斑）原位雜交篩選操作三.免疫學(xué)方法篩選1.利用免疫學(xué)方法篩選必備條件克隆基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物具備特異抗體2.標(biāo)記抗體檢測(cè)法3.免疫沉淀檢測(cè)法1.凝膠電泳檢測(cè)篩選2.限制酶譜分析篩選3.PCR法4.DNA測(cè)序法四.結(jié)構(gòu)分析篩選五.轉(zhuǎn)譯篩選法1.主要特點(diǎn)（1）能確定克隆DNA與其編碼蛋白質(zhì)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系（2）采用無細(xì)胞系體外翻譯系統(tǒng)2.兩種篩選策略及應(yīng)用（1）雜交阻斷轉(zhuǎn)譯法（2）雜交釋放轉(zhuǎn)譯法第六章 目的基因的獲得第一節(jié) 化學(xué)合成法獲得目的基因一.亞磷酸三脂法H3保護(hù)基團(tuán)G5保護(hù)基團(tuán) T 5

21、A保護(hù)基團(tuán)G保護(hù)基團(tuán)保護(hù)基團(tuán)OH 去5保護(hù)基團(tuán)OHH5CH25CH20G3214OPOOO03214OPOOOOH保護(hù)基團(tuán)保護(hù)基團(tuán)1.原理二.基因的組裝 三.化學(xué)合成寡核苷酸的應(yīng)用1.合成基因元件2.PCR引物3.核酸分子雜交的探針第二節(jié) PCR技術(shù)獲得目的基因一.PCR技術(shù)獲得目的基因全長(zhǎng)序列二.反轉(zhuǎn)錄PCR獲得目的基因cDNA1.已知目的基因序列的RT-PCR兩對(duì)可用的引物反義引物（逆轉(zhuǎn)錄引物:RT-GSP）與正義引物（GSP） Oligo（dT）12-18與正義引物（GSP）2.從基因編碼部分氨基酸序列出發(fā)的RT-PCRVal Phe Asn Ala Trp Lys Asp His可能的

22、DNA順序：GTN TTT/C AAT/C GCN TGG AAA/G GAT/C CAT/C 設(shè)計(jì)兼并引物已知N端部分氨基酸順序：（1）從氨基酸順序設(shè)計(jì)核酸引物（2）利用兼并引物RT-PCR操作獲得特異材料TTTTTAAAAA5353AAAAA53反轉(zhuǎn)錄33AAAAA5TTTTT5TTTTT335TTTTTAAAAA5Oligo（dT）兼并引物三.依據(jù)基因部分序列信息獲得基因全長(zhǎng)序列1.反向PCR分析某個(gè)已知區(qū)段兩端的未知序列巢式PCR嵌套引物2.盒式PCR（1）盒式PCR概念P136 （2）cassette概念P1363.RACE技術(shù)（1）概念P137（2）RACE種類 3RACE 5RA

23、CE四.錨定PCR技術(shù)獲得目的基因cDNA序列用于在體外擴(kuò)增未知DNA序列的方法獲得特異材料錨定引物AAAAA53mRNA反轉(zhuǎn)錄53AAAAATTTTT53sscDNAGGGAATTC CCCC5GGGAATTC CCCC5 dscDNAGGGGPCR53TTTTT5GGGAATTC CCCC5GGGG35GGGAATTC CCCC53 CCCTTAAGGGGG355GGGGDNA末端轉(zhuǎn)移酶去mRNA5TTTTT3第三節(jié) 篩選基因文庫獲取目的基因一.基因文庫概念及種類1.概念P1392.種類基因組文庫cDNA文庫二.基因文庫的構(gòu)建1.基因組文庫構(gòu)建克隆數(shù)的確定兩個(gè)重要參數(shù):基因組大小克隆DNA片段的平均大小2.基因組文庫構(gòu)建基本操作生物基因組DNA提取和DNA片段化載體選擇和制備DNA片段與載體連接重組載體導(dǎo)入微生物細(xì)胞初庫的擴(kuò)增保存終庫三.cDNA文庫的構(gòu)建1.基本操作過程（1）總RNA提?。?）mRNA的分離純化（3）cDNA的合成cDNA第一鏈合成雙鏈cDNA合成自身引物合成法置換合成法引導(dǎo)合成法-5端不完整dscDNA-接近全長(zhǎng)dscDNA-全長(zhǎng)d