愈傷組織褐化問題

1、5/5愈傷組織褐化問題：植物外植體組織在接種時(shí)的切割面會(huì)溢泌一些酚類物質(zhì)，在接觸空氣中的氧氣后其會(huì)氧化為相應(yīng)的醌類物質(zhì)，產(chǎn)生可見的茶色、褐色或黑色，此即謂“酚污染”。根據(jù)我個(gè)人所做可能有以下原因：1，基本培養(yǎng)基不適合，比如鹽濃度太高；2，激素濃度不適合，比太高的話容易造成愈傷組織疏松不結(jié)實(shí)，甚至水化、褐化；3、培養(yǎng)條件的不適合，比如關(guān)照太強(qiáng)，PH值不適合、硬度不夠等都有可能引起。 愈傷褐化問題是比較常見的，一般是新接種的比較輕，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在愈傷表面形成較為分散的褐化愈傷，主要是因?yàn)殡S著營(yíng)養(yǎng)元素和激素消耗分配的前后差異，造成表層細(xì)胞生理活性降低所致，當(dāng)然這個(gè)與物種的差異也比較大。一般解

2、決的辦法有：1、冷器械切割接種 2、縮短轉(zhuǎn)接時(shí)間 3、生長(zhǎng)素交替使用 4、低糖培養(yǎng) 5、降低光照強(qiáng)度和時(shí)間。褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會(huì)抑制其他酶的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現(xiàn)象。在組織培養(yǎng)中，褐變是普遍存在的，這種現(xiàn)象與菌類污染和玻璃化并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題。而控制褐變比控制污染和玻璃化更加困難。因此，能否有效地控制褐變是某些植物能否組培成功的關(guān)鍵。(一)褐變的原因影響褐變的因素極其復(fù)雜，隨著植物種類、基因型、外植體的部位及生理狀況

3、等的不同，褐變的程度也有所不同。1.與基因型有關(guān)不同植物與品種之間褐變現(xiàn)象是不同的，有人把此歸結(jié)為基因型的不同。一般來說植物材料中單寧類和多種羥酚類化合物的含量高，易引起外植體材料的嚴(yán)重褐化。多數(shù)木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。2.與取樣外植體的年齡有關(guān)通常幼齡部位產(chǎn)生褐化較輕，隨著組織的老齡化含醌類物質(zhì)增多而褐化加重。因此，在外植體接種時(shí)常需要?jiǎng)內(nèi)[片和大葉片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取頂芽分生組織(或帶少量葉原基)接種更為理想。3.與外植體取材時(shí)間有關(guān)一般在春夏季，尤其是春季采取生長(zhǎng)旺盛的外植體產(chǎn)生褐化較輕，已木栓化或木質(zhì)化的枝條和處于休眠狀態(tài)的芽

4、作為外植體時(shí)褐化嚴(yán)重。即分生部位接種后形成醌類物質(zhì)少，而分化的部位則形成醌類物質(zhì)較多。4.與培養(yǎng)基有關(guān)過高的無(wú)機(jī)鹽濃度會(huì)引起棕櫚科植物外植體酚的氧化，低鹽培養(yǎng)基，尤其是Mn2+和 Cu2+離子濃度較低時(shí)，外植體的褐化程度較輕。例如油棕用MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)容易引起外植體的褐變，而用降低了無(wú)機(jī)鹽濃度的改良MS培養(yǎng)基時(shí)則可減輕褐變，而且獲得愈傷組織和胚狀體。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)時(shí)，材料也容易褐變，細(xì)胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，這一現(xiàn)象在甘蔗的組織培養(yǎng)中十分明顯。培養(yǎng)基的PH值較低時(shí)常有利于減輕外植體的褐化。一般在液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基上褐化程度比在固體培養(yǎng)基上輕。5.培養(yǎng)條件不適宜

5、，如溫度過高、光照過強(qiáng)、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體的褐變。在咖啡組織培養(yǎng)中曾觀察到這一現(xiàn)象。6.材料轉(zhuǎn)移時(shí)間時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)引起材料的褐變，以致全部死亡。（二）褐變的防止措施1.選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基許多成功的經(jīng)驗(yàn)表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w并建立最佳的培養(yǎng)條件是防止外植體褐變最主要的手段。外植體材料應(yīng)有較強(qiáng)的分生能力，在最適宜的細(xì)胞脫分化與再分化的培養(yǎng)條件下，使外植體處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，便可大大減輕褐變。在培養(yǎng)條件的許多因子中，較為重要的是適宜的無(wú)機(jī)鹽成分、適宜的蔗糖濃度及激素水平。適宜的溫度及在黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)也可顯著減少材料的褐變。如能在初始培養(yǎng)的16周內(nèi)用暗培養(yǎng)，或在150lx左右的光強(qiáng)下進(jìn)行光培養(yǎng)，可抑制酚類物質(zhì)氧化。2.連續(xù)轉(zhuǎn)移對(duì)于易褐變的材料進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移可以減輕醌類物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用。在無(wú)刺黑莓的莖尖培養(yǎng)中，接種后12d就轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基；在山月桂樹的莖尖培養(yǎng)中，接種1224h便轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基，然后繼續(xù)每天轉(zhuǎn)移1次，連續(xù)7天，褐化便得到了完全控制。3.加抗氧化劑在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，或用抗氧化劑進(jìn)行材料的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，可預(yù)防醌類物質(zhì)的形成?？寡趸瘎┌箟难?、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白等。在靜止的液體培養(yǎng)基中加入抗氧化劑比在固體培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，效果要明顯得多