蛋白質(zhì)分離純化與鑒定課件

1、蛋白質(zhì)分離純化與鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室1、從血清獲得高純度的白蛋白2、掌握蛋白質(zhì)鹽析、 G-25葡聚糖凝膠層析脫鹽、DEAE-纖維素離子交換層析、 SDS電泳的原理與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)3、掌握考馬斯亮藍(lán)G250染色法定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的原理和操作方法4、了解紫外檢測(cè)儀、自動(dòng)部分收集器、記錄儀、恒壓高位槽的原理與使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)流程蛋白質(zhì)鹽析葡聚糖凝膠-25（脫鹽）DEAE-Cellulose離子交換（純化）蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)SDS電泳法 （鑒定蛋白質(zhì)純度）柱層析實(shí)驗(yàn)裝置UV monitorRecorderFraction CollectorColumnBufferReservoir柱

2、層析實(shí)驗(yàn)儀器一：HD-3紫外檢測(cè)儀波長(zhǎng)光量靈敏度電源調(diào)零根據(jù)光吸收原理設(shè)計(jì)，光源為紫外光，可監(jiān)測(cè)具有紫外吸收物質(zhì)(蛋白質(zhì)、核酸、多肽、酶)的檢測(cè)儀器，與層析柱、部份收集器及記錄儀配套，組成一個(gè)完整的液相色譜分離分析裝置。構(gòu)造和功能1. 檢查：連接是否正確，將“波長(zhǎng)”旋鈕旋到所需波長(zhǎng)刻度；2. 預(yù)熱：按下 “電源”開關(guān)，電源指示燈亮；3. 調(diào)100%：把“靈敏度”旋鈕選擇到“100”檔，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕，數(shù)字顯示為100，即透光率為100；4. 調(diào)零：把“靈敏度” 旋到所需檔（使用者自行掌握），緩慢調(diào)節(jié)“調(diào)零”旋鈕，數(shù)字顯示為“0”。備注：以上步驟需反復(fù)調(diào)節(jié)幾次。在樣品檢測(cè)過程中，不可再調(diào)節(jié)“調(diào)

3、零”、“光量”旋鈕。如繪出的圖譜即出峰過小，可改變“靈敏度”選擇檔，每檔成兩倍放大關(guān)系。使用方法柱層析實(shí)驗(yàn)儀器二：BSZ-100自動(dòng)部份收集器構(gòu)造和功能選擇置數(shù)手/自動(dòng)切換復(fù)位按照設(shè)定的時(shí)間自動(dòng)收集樣品使用方法1. 打開：按“電源” ；2. 調(diào)零：按“量程/零位” 鍵，零位指示燈亮，數(shù)碼管顯示“Po”，按左移或右移鍵，使記錄筆移至所需零位；3. 選擇量程：按“量程/零位” 鍵，量程指示燈亮，數(shù)碼管顯示當(dāng)前量程范圍，按增加或減少鍵，使量程為10mV；4. 調(diào)紙速：按“啟/?！辨I，“紙速顯示” 閃爍，按“調(diào)速”鍵調(diào)節(jié)紙速，確定后按“啟/?！辨I；5. 記錄：取下記錄筆的塑料筆套，壓下“抬/落筆手柄”

4、；實(shí)驗(yàn)原理一：鹽析鹽析salting out高濃度的中性鹽可以中和蛋白質(zhì)表面電荷、奪取蛋白質(zhì)周圍的水化膜，破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性，從而將蛋白質(zhì)從溶液中析出。常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等+水化膜實(shí)驗(yàn)操作一：鹽析0.5ml Serum0.5ml s(NH4)2SO4Mix5000rpm/10min SupernatantPrecipitate上清轉(zhuǎn)至另一Ep管備用；沉淀0.5ml dH2O，離心，留上清液備用。(白蛋白和球蛋白分別留200ul用于電泳上樣) 實(shí)驗(yàn)操作二： G-25葡聚糖凝膠層析脫鹽1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac緩沖液平衡G-25柱，紫外檢測(cè)儀、記錄儀基線穩(wěn)定

5、;2. 上樣:取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面;3.洗滌:樣品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗滌柱壁1次;4. 收集:將0.02mol/LNH4Ac緩沖液充滿層析柱，與高位恒壓槽連通，同時(shí)開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；5. 再次平衡:繼續(xù)用0.02mol/LNH4Ac流洗直到記錄儀基線恢復(fù)到零。 實(shí)驗(yàn)原理三：DEAE-Cellulose離子交換層析離子交換層析ion exchange chromatography 離子交換層析分離蛋白質(zhì)示意圖低鹽洗脫液高鹽洗脫液混合蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作三：純化1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac緩沖液平衡離子交

6、換柱，紫外檢測(cè)儀、記錄儀基線穩(wěn)定;2. 上樣:取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面;3.洗滌:樣品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗滌柱壁1次;4. 收集-球蛋白:將0.02mol/LNH4Ac緩沖液充滿層析柱，與高位恒壓槽連通，開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；5. 洗滌其他球蛋白:記錄儀基線恢復(fù)到零后,用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用進(jìn)行收集實(shí)驗(yàn)操作四：蛋白質(zhì)定量充分混勻后以1管調(diào)零，在595nm處測(cè)定各管吸光度。然后以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度An作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出檢測(cè)管吸光度對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)白蛋

7、白（l）蒸餾水（l ）考馬斯亮藍(lán)G250（ml）1234567測(cè)定33333330.030.0樣品546 4848 12 24 36 12 24 36 06036003實(shí)驗(yàn)原理五：SDS電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS SDS polyacrylamide gel electrophoresisSDS帶負(fù)電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵，使之形成單個(gè)亞基。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的長(zhǎng)橢圓棒，消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。SDS -蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)有關(guān)。 上電極緩沖液下電極緩沖液樣品槽上樣器陰極陽極電泳方向聚丙烯酰胺凝膠板實(shí)驗(yàn)原理五：SD

8、S電泳實(shí)驗(yàn)操作五：SDS電泳1. 制膠： 試劑 分離膠（ml） 濃縮膠（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%單體 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸餾水 3.84 6.340.5M Tris-HCl （pH 6.8） 2.5010%過硫酸銨AP 0.05 0.05四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.012. 樣品處理：Loading buffer40%甘油溴酚蘭SDS-巰基乙醇0.5M Tris-HCl（pH 6.8）50ul樣品50ul(2)Loading buffer Mix950C/5min 3. 上樣：4. 電泳：5. 剝膠和染色：6. 漂洗：濃縮膠電流：8mA，分離膠電流：18mA待示蹤染料遷移至膠底時(shí)，關(guān)掉電源，停止電泳。 將凝膠剝離，用考馬斯亮藍(lán)R250染色2h用甲醇：冰醋酸：水=3：1：6比例配制漂洗液，少量多次進(jìn)行漂洗直至凝膠脫色思考題1、紫外檢測(cè)儀的數(shù)據(jù)與記錄儀的圖形之間有無定量關(guān)系？為什么？2、采取那些方法可以調(diào)節(jié)流速？不同大小的流