高三一輪復(fù)習(xí)生物：第2節(jié) 基因工程的基本操作程序課件

1、02.基因工程的基本操作程序基因工程1.目的基因的獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定步驟目的基因的獲取11.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫1.基因文庫概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）（cDNA文庫）RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的1.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)?限制酶一定大小的DNA片段將DNA片段 與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫

2、（1）基因組文庫的構(gòu)建鳥槍法1.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）（2） cDNA文庫的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄法提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體 連接cDNA文庫逆轉(zhuǎn) 錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌 中儲(chǔ)存為什么cDNA文庫中僅有該種生物的部分基因？基因的選擇性表達(dá)DNA重組逆轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNADNA單鏈1.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）鞏固練習(xí)1.構(gòu)建基因組DNA文庫時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的（ ） A.染色體DNA B.線粒體DNA C.總mRNA D.tRNA 2. 下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是（ ）A.某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫B.

3、將含有某種生物不同的許多DNA片段導(dǎo)入某個(gè)生物體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫C.含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D.含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC1.2從已知結(jié)構(gòu)和功能的基因中篩選測序技術(shù)1.序列數(shù)據(jù)庫包含已知核酸序列和蛋白質(zhì)序列及相關(guān)文獻(xiàn)和生物學(xué)注解例如：GenBank2.序列比對(duì)工具對(duì)比核酸或蛋白質(zhì)序列，從數(shù)據(jù)庫中找到相同或相似序列例如：BLAST (basic local alignment search tool)1.3利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），是一種體外復(fù)制DNA的技術(shù)，通過控

4、制溫度使復(fù)制過程反復(fù)進(jìn)行。PCR技術(shù)哪些組分參與DNA的復(fù)制過程？模板原料酶雙鏈DNA4種脫氧核糖核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物小的核苷酸片段高溫耐高溫Taq酶設(shè)計(jì)特定引物獲取目的基因1.3利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因DNA雙鏈引物脫氧核苷酸變性90以上雙鏈解開50左右引物結(jié)合復(fù)性72左右合成新鏈延伸循環(huán)1.4人工合成目的基因推測推測合成1、前提：基因比較小、核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因2、儀器：DNA合成儀3、過程：基因表達(dá)載體的構(gòu)建22基因表達(dá)載體的構(gòu)建思考作為載體都需要具備哪些條件？有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)能夠自我復(fù)制或整合到受體DNA

5、上具有標(biāo)記基因表達(dá)載體呢？轉(zhuǎn)錄DNAmRNA啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)終止子：終止轉(zhuǎn)錄目的基因穩(wěn)定遺傳目的基因表達(dá)并發(fā)揮作用2基因表達(dá)載體的構(gòu)建切割同種限制酶產(chǎn)生相同末端的限制酶縫合利用DNA連接酶將目的基因接到載體切口處目的基因載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞33.1將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1.花粉管通道法重組表達(dá)載體DNA借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞3.1將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞2.基因槍法利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的重組表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞。成本較高，常用于單子葉植物。3.1將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞并整

6、合到其染色體上。優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化頻率高、成本低、操作相對(duì)簡單。在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，占據(jù)主導(dǎo)地位，主要用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因。Bt基因復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因KanR啟動(dòng)子終止子pBI121表達(dá)載體T-DNAT-DNA3.2將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射法pTol2-GFPGFP哪個(gè)發(fā)育階段導(dǎo)入，導(dǎo)入到哪種細(xì)胞？受精卵3.3將目的基因?qū)胛⑸锍Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA受體生物 植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法體細(xì)胞受精卵受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理感受態(tài)細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定4Bt基因是否成功導(dǎo)入？Bt基因是否表達(dá)？Bt抗蟲蛋白是否發(fā)揮作用？4.1分子水平的檢測檢測是否插入目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否翻譯4.1分子水平的檢測檢測是否插入目的基因DNA分子雜交熒光標(biāo)記的DNA探針4.1分子水平的檢測檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄DNA-RNA分子雜交熒光標(biāo)記的DNA探針4.1分子水平的檢測檢測是否插入目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否翻譯DNA分子雜