高三一輪復(fù)習生物：第2節(jié) 基因工程的基本操作程序課件

1、02.基因工程的基本操作程序基因工程1.目的基因的獲取2.基因表達載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定步驟目的基因的獲取11.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫1.基因文庫概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）（cDNA文庫）RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的1.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）提取某種生物的全部DNA用適當?shù)?限制酶一定大小的DNA片段將DNA片段 與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫

2、（1）基因組文庫的構(gòu)建鳥槍法1.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）（2） cDNA文庫的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄法提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體 連接cDNA文庫逆轉(zhuǎn) 錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌 中儲存為什么cDNA文庫中僅有該種生物的部分基因？基因的選擇性表達DNA重組逆轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNADNA單鏈1.1從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）鞏固練習1.構(gòu)建基因組DNA文庫時，首先應(yīng)分離細胞的（ ） A.染色體DNA B.線粒體DNA C.總mRNA D.tRNA 2. 下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是（ ）A.某生物的全套基因就是一個基因文庫B.

3、將含有某種生物不同的許多DNA片段導(dǎo)入某個生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫C.含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D.含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC1.2從已知結(jié)構(gòu)和功能的基因中篩選測序技術(shù)1.序列數(shù)據(jù)庫包含已知核酸序列和蛋白質(zhì)序列及相關(guān)文獻和生物學注解例如：GenBank2.序列比對工具對比核酸或蛋白質(zhì)序列，從數(shù)據(jù)庫中找到相同或相似序列例如：BLAST (basic local alignment search tool)1.3利用PCR獲取和擴增目的基因聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction），是一種體外復(fù)制DNA的技術(shù)，通過控

4、制溫度使復(fù)制過程反復(fù)進行。PCR技術(shù)哪些組分參與DNA的復(fù)制過程？模板原料酶雙鏈DNA4種脫氧核糖核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物小的核苷酸片段高溫耐高溫Taq酶設(shè)計特定引物獲取目的基因1.3利用PCR獲取和擴增目的基因DNA雙鏈引物脫氧核苷酸變性90以上雙鏈解開50左右引物結(jié)合復(fù)性72左右合成新鏈延伸循環(huán)1.4人工合成目的基因推測推測合成1、前提：基因比較小、核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因2、儀器：DNA合成儀3、過程：基因表達載體的構(gòu)建22基因表達載體的構(gòu)建思考作為載體都需要具備哪些條件？有一個或多個限制酶切割位點能夠自我復(fù)制或整合到受體DNA

5、上具有標記基因表達載體呢？轉(zhuǎn)錄DNAmRNA啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合位點終止子：終止轉(zhuǎn)錄目的基因穩(wěn)定遺傳目的基因表達并發(fā)揮作用2基因表達載體的構(gòu)建切割同種限制酶產(chǎn)生相同末端的限制酶縫合利用DNA連接酶將目的基因接到載體切口處目的基因載體將目的基因?qū)胧荏w細胞33.1將目的基因?qū)胫参锛毎?.花粉管通道法重組表達載體DNA借助花粉管通道進入受體細胞3.1將目的基因?qū)胫参锛毎?.基因槍法利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的重組表達載體DNA打入受體細胞。成本較高，常用于單子葉植物。3.1將目的基因?qū)胫参锛毎?.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至植物細胞并整

6、合到其染色體上。優(yōu)點：轉(zhuǎn)化頻率高、成本低、操作相對簡單。在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，占據(jù)主導(dǎo)地位，主要用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因。Bt基因復(fù)制原點標記基因KanR啟動子終止子pBI121表達載體T-DNAT-DNA3.2將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法pTol2-GFPGFP哪個發(fā)育階段導(dǎo)入，導(dǎo)入到哪種細胞？受精卵3.3將目的基因?qū)胛⑸锍Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA受體生物 植物動物微生物受體細胞導(dǎo)入方法體細胞受精卵受精卵細胞/個體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理感受態(tài)細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定4Bt基因是否成功導(dǎo)入？Bt基因是否表達？Bt抗蟲蛋白是否發(fā)揮作用？4.1分子水平的檢測檢測是否插入目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否翻譯4.1分子水平的檢測檢測是否插入目的基因DNA分子雜交熒光標記的DNA探針4.1分子水平的檢測檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄DNA-RNA分子雜交熒光標記的DNA探針4.1分子水平的檢測檢測是否插入目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否翻譯DNA分子雜