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文檔簡介
1、第一章 緒 論何謂酶工程,試述其主要內容和任務。酶的生產(chǎn)、改性與應用的技術過程稱為酶工程。酶工程的主要內容包括:微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶,動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,酶的提取與分離純化,酶分子修飾,酶、細胞、原生質體固定化,酶非水相催化,酶定向進化,酶反應器和酶的應用等。酶工程的主要任務是經(jīng)過預先設計,通過人工操作獲得人們所需的酶,并通過各種方法使酶的催化特性得以改進,充分發(fā)揮其催化功能。酶有哪些顯著的催化特性?酶是生物催化劑,與非酶催化劑相比,具有專一性強、催化效率高和作用條件溫和等顯著特點。簡述影響酶催化作用的主要因素。酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響
2、。5. 簡述酶活力單位的概念和酶活力的測定方法。酶活力單位:在特定條件下(溫度可采用25C, pH等條件均采用最適條件),每1min催化1 mol的底物轉化為產(chǎn)物的酶量定義為1 個酶活力單位,這個單位稱為國際單位(IU) 。在特定條件下,每秒催化1mol 底物轉化為產(chǎn)物的酶量定義為1 卡特( kat )酶活力的測定方法:振蕩測定法,酶柱測定法,連續(xù)測定法,固定化酶的比活力測定,酶結合效率與酶活力回收率的測定,相對酶活力的測定?;蛘邷y定方法:化學測定法、光學測定法、氣體測定法其它 .酶的發(fā)展歷史:4000 多年前的夏禹時代釀酒技術。 3000 多年前的周朝制造飴糖、食醬等食品。 1833 年佩恩
3、和帕索茲從麥芽的水抽提物中得到淀粉酶。 19 世紀中葉巴斯德對酵母的乙醇發(fā)酵進行研究。1913 年米徹利斯和曼吞根據(jù)中間產(chǎn)物學說,推導出米氏方程。 1926 年薩姆納得到脲酶結晶,并證明它具有蛋白質的性質。1960 年雅各和莫諾德提出操縱子學說。 1982 年切克發(fā)現(xiàn)核酸類酶。1983年一一阿爾特曼發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶P的RNA部分M1RNAM有核糖核酸酶 P的催化活性。酶的專一性分為絕對專一性和相對專一性。相對專一性又可分為鍵專一性和基團專一性米氏方程:酶的可逆性抑制作用可以分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。Km增大不變減小Vm不變減小減小酶的生產(chǎn)方法:提取分離法,生物合成法,化學合成法
4、第二章經(jīng)過預先設計,通過人工操作,利用微生物的生命活動獲得所需要的酶的技術過程,稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。酶的發(fā)酵生產(chǎn)是當今產(chǎn)酶的主要方法,因為微生物具有種類多、繁殖快、易培養(yǎng)、代謝能力強等特點。試述酶生物合成的基本過程。a. RNA的生物合成一一轉錄:轉錄的起始、RNA鏈的延伸、轉錄的終止、RN麗體加工成為成熟的 RNA 分子。b.蛋白質的生物合成一一翻譯:氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽鏈合成的起始、肽鏈的延伸、肽鏈合成的終止、蛋白質前體加工修飾成具有特定空間結構的功能蛋白。何謂酶生物合成的誘導作用?是簡述其原理。加入某些物質使酶的生物合成開始或加速進行的現(xiàn)象,稱為酶生物合成的誘導作用。原理:當無
5、誘導物存在時,調節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結合,覆蓋RNA聚合酶的結合部位,RNA聚合酶無法與啟動基因結合,結構基因無法轉錄,酶合成受受阻。當誘導物存在時,其與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白構象發(fā)生改變而降低與操縱基因的結合能力,RNA聚合酶與啟動基因結合,結構基因正常轉錄,相應酶得以表達。什么是酶生物合成的反饋阻遏作用?試簡述其原理。酶生物合成反饋阻遏作用指酶催化反應的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使酶的生物合成受到阻遏。原理:無阻遏物存在時,調節(jié)基因產(chǎn)物阻遏蛋白無法與操縱基因結合,結構基因正常轉錄,相應酶得以正常表達。當阻遏物存在時,其與阻遏蛋白結合使之空間構象發(fā)生改變,阻遏蛋白與操縱基因結合,抑
6、制RNA聚合酶與啟動基因的結合,下游結構基因轉錄受阻,酶無法正常表達。簡述分解代謝的阻遏作用的原理及解除方法。分解代謝阻遏之所產(chǎn)生, 是因為細胞內某些物質經(jīng)分解代謝產(chǎn)生ATP, ATP則是由AD可口 AMPg磷酸化轉變而來,ATP合成,即意味著胞內 ADP AM秫度下降,cAMP通過水解作用以補充胞內 AM秫度,故 胞內cAM限度下降。同時腺甘酸環(huán)化酶活性降低,cAM*成受阻,致使胞內 cAM限度進一步降低。故而cAMP-CAPT合物濃度隨之降低,啟動基因特定部位無足夠cAMP-CAPM合物與之結合從而抑制了RNA聚合酶與啟動基因的結合,結構基因無法表達,酶合成受阻。解除方法:在培養(yǎng)環(huán)境中控制
7、某種易降解物質的量,或在必要時添加適量的cAMP。酶的生物合成有哪幾種模式?同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型。6、如何控制微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件?a .保藏的菌種用于生產(chǎn)之前要通過細胞活化使細胞的生命活力得以恢復;b.根據(jù)不同細胞和不同用途的不同要求配置各營養(yǎng)組分適宜的培養(yǎng)基;c. 根據(jù)不同菌種、不同產(chǎn)物、不同工藝條件等不同情況調節(jié)培養(yǎng)基pH、溫度、溶解氧量使之處于適宜狀態(tài)。7提高酶產(chǎn)量的措施主要有哪些?添加誘導物、控制阻遏物濃度、添加表面活性劑、添加產(chǎn)酶促進劑。簡述固定化微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點?提高產(chǎn)酶;可以反復使用或連續(xù)使用較長時間;基因工程菌的質粒穩(wěn)定、不易丟失;發(fā)酵穩(wěn)
8、定性好;縮短發(fā)酵周期,提高設備利用率;產(chǎn)品容易分離純化;適于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。固定化微生物原生質體發(fā)酵產(chǎn)酶有何特點?變胞內產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物;提高產(chǎn)酶率;穩(wěn)定性較好;易于分離純化。2,何為抗體酶?試述獲得抗體酶的主要方法。答:抗體酶又稱為催化性抗體,是一類具有生物催化功能的抗體分子。)半抗原誘導法。以預先設計的過渡態(tài)類似物作為半抗原,與載體蛋白(如牛血清蛋白)偶聯(lián)制成抗原,然后免疫動物,再經(jīng)過單克隆抗體制備技術制備,分離,篩選得到所需的抗體酶。)酶蛋白誘導法。是以某種酶蛋白作為抗原誘導抗體酶產(chǎn)生的方法。首先選定一種酶蛋白作為抗原來免疫某種動物,在酶蛋白抗原的誘導下,動物體內產(chǎn)生與酶分子特異結
9、合的抗體;再將獲得的酶抗體來免疫該動物,并采用單克隆抗體制備技術制備得到與酶抗體特異結合的抗抗體。那么抗抗體結合部位的構象與用作抗原的酶分子的結合中心的構象相同。對抗抗體進行篩選,就有可能獲得具有催化活性的抗體酶。3,植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶有何特點?答: 1 )產(chǎn)率高。2)生產(chǎn)周期(與完整植株相比較)短,一般為1530 天。3)易于管理,減輕勞動強度。4)提高產(chǎn)品質量。5)其他:對剪切力敏感,生產(chǎn)周期長,許多植物細胞的生長和代謝需要一定的光照。5,試述植物細胞產(chǎn)酶的工藝條件及其控制。答: 1 )溫度的控制。一般為25 度左右。通常不高于35 度,不低于20 度。PH的控制。一般為。通常介于的微酸性范
10、圍。3)溶解氧的調節(jié)控制。一般通過通風和攪拌來供給。不能太強烈,以免破壞細胞。4)光照的控制。根據(jù)植物細胞的特性及目標次級代謝物的種類不同,進行光照的調控。5)前體的添加。為提高次級代謝物產(chǎn)量在培養(yǎng)過程中添加目的代謝物的前體。6)刺激劑的應用。促使植物細胞的物質代謝朝著生成某些次級代謝物的方向進行,強化次級代謝物的生物合成,提高某些次級代謝物的產(chǎn)率。6,動物細胞培養(yǎng)過程中要注意控制哪些工藝條件?答:1 )溫度。一般在度,允許波動范圍在度之內。PH 一般在條件下生長最好,通常在的微堿性范圍內。滲透壓。一般在700850kPa 范圍內。溶解氧。一般通過調節(jié)進入反應器的混合氣體的量及其比例調控溶解氧
11、?;旌蠚怏w由空氣,氧氣,氮氣,二氧化碳四種氣體組成。二氧化碳兼有調節(jié)供氧和調節(jié)PH的雙重作用。7,舉例說明動物細胞產(chǎn)酶的工藝過程。答:以生產(chǎn)組織纖溶酶原活化劑為例:)配制人黑色素瘤細胞培養(yǎng)基。)人黑色素瘤細胞培養(yǎng):A 將人黑色素瘤的種質細胞用胰蛋白酶消化處理,細胞分散后,用的磷酸緩沖液洗滌,計數(shù),稀釋成細胞懸浮液;B 在消毒好的反應器中裝進一定量的培養(yǎng)液,將上述細胞懸浮液接種至反應器中,接種濃度為10003000個細胞/ml ,于37度的CO綿養(yǎng)箱中,通入含 5%CO2勺無菌空氣,培養(yǎng)至長成單層致密細胞;C 傾去培養(yǎng)液,用的磷酸緩沖液洗滌細胞23 次;D 換入一定量的無血清Eagle 培養(yǎng)液,
12、繼續(xù)培養(yǎng);E 每隔34天,取出培養(yǎng)液進行tPA (組織纖溶酶原活化劑)的分離純化;F 再向反應器中加入新鮮的無血清Eagle 培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),以獲得大量tPA。)組織纖溶酶原活化劑的分離純化。在獲得的上述培養(yǎng)液中加入一定量的蛋白酶抑制劑和表面活性劑,過濾去沉淀,適當稀釋后,采用親和層系技術進行分離,得到tPA 溶液。經(jīng)過濃縮,葡聚糖G-150 凝膠層次,冷凍干燥,得到精制tPA 干粉。第四章細胞破碎的方法:機械破碎法通過機械運動產(chǎn)生剪切力,使組織細胞破碎物理破碎法通過各種物理因素,使組織細胞的外層結構破壞,而使細胞破碎化學 通過各種化學試劑對細胞膜的作用,從而使細胞破碎酶促 通過細胞本身的酶
13、系或外加酶制劑的催化作用,使細胞外層結構受到破壞,從而達到細胞破碎. 酶提取主要方法:鹽溶液提取酸 堿 有機溶劑提取酶沉淀分離方法的原理P-91 表 4-3特點:鹽析法主要用于蛋白類酶的分離純化,鹽析時,溫度一般維持室溫,對溫度敏感的酶應低溫條件,溶液的 PH應調到欲分離的酶等電點附近等電點 主要用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白。加酸或加堿的過程中,要一邊攪拌一邊慢慢加,以防局部過酸或過堿,引起酶變性失活。有機溶劑 分離效果受溶液 PH的影響。該方法比鹽析法洗出的沉淀易于離心或過濾分離,不含無 極鹽,分辨率也高,但容易引起酶變性失活,所以必須在低溫條件下操作,而且沉淀析出后要盡快分
14、離,減少有機溶劑對酶的影響復合;復合沉淀劑與酶形成復合物,溶解度降低選擇性 對酶沒有明顯影響膜分離技術借助一定孔徑的高分子膜,將不同大小不同形狀不同特征的物質顆?;蚍肿舆M行分離的技術稱為應用 超濾 蛋白質除鹽濃縮及分離純化反滲透 海水淡化電場膜分離:脫鹽海水淡化純水制備,從發(fā)酵液中分離檸檬酸,谷氨酸及凝膠電洗脫。超臨界萃取又稱超臨界流體萃取,是利用欲分離物質與雜質在超臨界流體中溶解度不同而達到分離的一種萃取技術特點 P-129雙水相 利用溶質在兩個互不相溶的水相中溶解度不同而達到分離特點 P-128 影響因素第3 段離子交換層析利用離子交換劑的可解離集團對各種離子的親和力不同而達到分離目的一種
15、層析分離方法。要點 離子交換劑的選擇處理 裝柱 上柱 洗脫和收集再生親和 利用生物分子與配基之間所具有的可逆親和力,使生物分子分離純化的技術控制好溫度PH 等條件,以免酶失活母體和配基的偶聯(lián)結合凝膠 利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離的一種層析技術操作要點制備膠時,防止氣泡產(chǎn)生,為此將各種所需比例的貯存液混合以后,應該抽氣處理2 洗脫液體積一般為凝膠床體積的120% 3 上柱體積為凝膠床10%,不得超過30% 凝膠的選擇與處理裝柱 上柱 洗脫連續(xù)凝膠電泳:只用一層凝膠,采用相同的PH和相同的緩沖液不:采用2或3層性質不同的凝膠重疊起來使用,采用 2中不同的PH和不同緩沖液
16、,能使?jié)舛容^低的各種組分在電泳過程中濃縮成層,從而提高分辨率梯度 : 采用自上而下濃度逐漸升高,孔徑逐漸減小的梯度凝膠電泳。主要測定球類蛋白質的分子質量SDS- 凝膠電泳巰基乙醇能使蛋白質分子中二硫鍵還原,SDS 能使蛋白質分子的請柬,疏水鍵打開,并與蛋白質分子結合。為此,蛋白質SDS 復合物遷移速率不再受蛋白質原有電荷及分子形狀影響,只取決于蛋白質相對分子質量。酶結晶方法鹽析 有機溶劑 透析平衡 等電點 溫度差 金屬離子復合技術 :細胞破碎提取 細心分離過濾與膜分離沉淀分離層析分離電泳分離萃取分離濃縮 干燥 結晶第五章酶的分子修飾1,試述酶分子修飾的概念和作用答:概念:通過各種方法使酶分子的
17、結構發(fā)生某些改變從而改變酶的催化活性的技術過程。作用:酶的分子結構發(fā)生某些合理改變有可能提高酶的催化效率,增加酶的穩(wěn)定性,降低或消除酶的抗原性,改變酶的底物專一性。同時在酶學和酶工程研究方面具有重要的意義。2,何謂金屬離子置換修飾?簡述其主要修飾過程和作用答:概念:把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法。過程:酶的分離純化,除去原有的金屬離子,加入置換離子作用: 1 ,闡明金屬離子對酶的催化作用的影響2 ,提高酶的催化效率3 ,增強酶的穩(wěn)定性4 ,改變酶的動力學特性3,何謂大分子結合修飾?有何作用?答:概念:采用水溶性大分子與酶的側鏈基團共價結合,使酶的分子空間
18、構象發(fā)生改變,從而改變酶的催化特性的方法。作用: 1 ,通過修飾提高酶的催化效率2 ,增強酶的穩(wěn)定性3 ,通過修飾降低或消除酶蛋白的抗原性4,簡述定點突變技術的主要技術過程及其在酶分子修飾中的應用定點突變:指在 DN際列中的某一特定位點上進行堿基的改變,從而獲得突變基因的操作技術過程:1 ,新酶分子結構的設計,突變基因堿基序列的確定,突變基因的獲得,新酶的獲得應用:定點突變技術為氨基酸置換修飾和核苷酸置換修飾提供了先進可靠行之有效的手段??贵w酶:是一類具有催化功能的抗體第六章1953 年德國的格魯布霍費(Grubhofer )和施萊恩(Schleith )采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體,經(jīng)重氮化法
19、活化后,分別與羧肽酶,淀粉酶,胃蛋白酶,核糖核酸酶等結合而制成固化酶。固定化酶是指固定在一定載體上并在一定空間范圍內進行催化反應的酶。固定化方法:吸附法,包埋法,結合法,交聯(lián)法和熱處理法等。吸附法:利用各種固體吸附將酶或含酶菌體吸附在其表面上,而使酶固定化的方法稱為物理吸附法,簡稱吸附法。包埋法:將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中,使酶固定的方法。包括凝膠包埋法和半透膜包埋法。結合法:選擇適宜的載體,使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定方法稱為結合法。交聯(lián)法:借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用,生成網(wǎng)狀結構的固定化酶法稱為交聯(lián)法。熱處理法:將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間,使酶
20、固定在菌體內而制備得到固定化酶的方法。(只適應熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化)固化酶特性:穩(wěn)定性(1 )熱穩(wěn)定性提高(2)保存穩(wěn)定性好(3)對蛋白酶的抵抗性增強不易被蛋白酶水解(4)對變性劑的耐受性提高最適溫度與游離酶差不多,活化能變化不大,部分固化酶最適溫度與游離酶相比,有明顯變化。最適PH影響固化酶PH因素主要有兩個(1)載體帶電性質,明顯影響。(2)產(chǎn)物性質對最適 PH影響, 有一定影響底物特異性不同于游離酶,其變化與底物分子質量的大小有一定關系。固化酶應用:工業(yè)產(chǎn)業(yè),醫(yī)藥,食品,輕工,分析,環(huán)保,能源和科學研究通過各種方法將細胞固定在水不溶性的載體上,紙杯固定化細胞的過程稱為細胞固定化。特點
21、:提高產(chǎn)率,增加穩(wěn)定性,利于分離純化,提高產(chǎn)品質量。固定化微生物細胞應用:發(fā)酵和制成微生物電極固定化植物細胞:人工種子,生產(chǎn)色素,香精固定化動物細胞:生產(chǎn)疫苗第七章簡述酶非水相催化的概念與特點?答:酶在非水介質中的催化作用稱為酶的非水相催化。它是通過改變反應介質,影響酶的表面結構和活性中心,從而改變酶的催化特性。主要內容包括有機介質中的酶催化,氣相介質中的酶催化,超臨界流體介質中的酶催化和離子液介質中的酶催化等。由于在非水相介質中酶分子受到非水介質的影響,起催化特性與在水相中的有較大的不同。酶在有機介質中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中有顯著地提高,而且催化時,酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵
22、的選擇性和熱穩(wěn)定性都有所改變,同時酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵的選擇性等顯著特點。酶在有機溶劑介質中與在水溶液中的特性有何改變?答:底物專一性:酶在水溶液中進行催化反應時,具有高度的底物專一性,或稱為底物特異性,是酶催化反應的顯著特點之一。在有機介質中,由于酶分子活性中心的結合部位與底物之間的結合狀態(tài)發(fā)生了某些變化,致使酶的底物特異性發(fā)生改變。對稱體選擇性:酶在有機介質中催化,由于介質的特性發(fā)生改變,從而引起酶的對稱體選擇性也發(fā)生改變。酶在水溶液中催化的立體選擇性較強,而在疏水性強的有機介質中,酶的立體選擇性較差。區(qū)域選擇性:酶在有機介質中進行催化時,具有
23、區(qū)域選擇性,即酶能夠 選擇底物分子中某一區(qū)域的基團優(yōu)先進行反應。鍵選擇性:在同一個底物分子中有兩種以上的化學鍵都 可以與酶反應時,酶對其中一種化學鍵優(yōu)先進行反應。熱穩(wěn)定性:許多酶在有機介質中的熱穩(wěn)定性比在 水溶液中的熱穩(wěn)定性更好。在有機介質中,酶的熱穩(wěn)定性之所以增強,可能是由于有機介質中缺少引起酶分子變性失活的水分子所致。PH特性:在水溶液中,緩沖液的PH決定了酶分子活性中心基團的解離狀態(tài)和底物分子的解離狀態(tài),從而影響酶與底物的結合和催化反應。在有機介質反應中,酶所處的PH 環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所用的緩沖液PH相同(這種現(xiàn)象稱為 PH印記或PH記憶)。酶在有機介質中催化反應的最適
24、PH通常與酶在水溶液中反應的最適PH接近或者相同。什么是必需水和水活度?水對非水相中酶的特性有何影響?答:必需水:維持酶分子完整的空間構象所必需的最低水量稱為必需水。水活度(Aw) :是指體系中水的逸度與純水逸度之比。通??梢杂皿w系中水的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比表示。即Aw=P/P0式中,P為在一定條件下體系中水的蒸汽壓;P0為在相同條件下純水的蒸汽壓。影響:水對酶分子空間構象的影響:酶分子只有在空間構象完整的狀態(tài)下,才具有催化功能。在無水的條件下,酶的空間構象被破壞,酶將變性失活。所以,酶分子需要一層水化層,以維持其完整的空間構象。水對酶催化反應速度的影響:有機介質中水的含量對酶催
25、化反應速度有顯著影響。有的酶在水含量較低的條件下,酶的催化反應速度隨水含量的增高而升高。在催化反應速度達到最大時的水含量稱為最適水含量。在有機介質體系中,酶的催化活性會隨著結合水量的增加而提高。在結合水量不變的條件下,體系中水含量的變化對酶的催化活性影響不大。有機溶劑對酶催化有何影響?答:有機溶劑對酶結構與功能的影響:有機溶劑對酶分子表面結構的影響;有機溶劑對酶活性中心結合位點的影響,主要是通過有機溶劑與底物競爭活性中心的結合位點,降低底物的結合能力,從而影響酶的催化活性。有機溶劑對酶活性的影響:極性較強的有機溶劑會奪取酶分子的結合水,影響酶分子微環(huán)境 的水化層,從而降低酶的催化活性,甚至引起
26、酶的變性失活。有機溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響:有機 溶劑極性過大或過小都會影響底物的濃度從而影響酶的催化速度。如何控制有機介質中酶催化反應的條件?答: 對酶的選擇不但要看催化反應速度的大小,還要特別注意酶的穩(wěn)定性、底物專一性、對映體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性等底物的選擇和濃度控制:根據(jù)酶在所使用的有機介質中的專一性選擇適宜的底物并且使底物濃度持續(xù)維持在一定的濃度范圍內。酶在有機介質中進行催化時,要考慮底物在有機溶劑和必需水層中的分配情況。有機溶劑的選擇:它的極性選擇要恰當,不能過強或過弱。水含量的控制:使反應體系保持在最適水含量。溫度控制:最好在最適溫度。PH的控制:保持在最適 PH,可以通
27、過調節(jié)緩沖溶液的 PH和離子強度的方法對有機介質中酶催化的PH和離子強度進行調節(jié)控制。舉例說明酶非水相催化的應用?答:手性藥物的拆分手性高分子聚合物的制備 酚樹脂的合成 導電有機聚合物的合成發(fā)光有機聚合物的合成食品添加劑的生產(chǎn) 生物柴油的生產(chǎn)多肽的合成甾體轉化知識點:( 1)酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應;也可以在水和有機溶劑組成的雙液相體系中進行催化反應;還可以在只含有微量水的有機介質,又稱為微水介質中進行催化反應。( 2)非水酶學就是酶非水相催化。(3)酶的非水相催化w酶在有機介質中的催化。( 4)在酶的非水相催化中,研究最多的非水介質是有機溶劑。有機介質中的酶催化是指酶在含
28、有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質的酶催化作用。( 5)有機介質體系包括:( 1)微水介質體系(2)與水溶性有機溶劑組成的均一體系(3)與水不溶性有機溶劑組成的兩相或體系(4)正膠束體系(5)反膠束體系。微水介質體系是由有機溶劑和微量的水組成的反應體系,是在有機介質酶催化中廣泛應用的一種反應體系。通常所說的有機介質反應體系主要是指微水介質體系。能在與水溶性有機溶劑組成的均一體系中進行催化反應的酶較少。膠束又稱為正膠束或正膠團,是在大量水溶液中含有少量與水不相混溶的有機溶劑,加入表面活性劑后形成的水包油的微小液滴。表面活性劑的極性端朝外,非極性端朝內
29、,有機溶劑被包在液滴內部。反膠束又稱為反膠團,是指在大量與水不相混溶的有機溶劑中,含有少量的水溶液,加入表面活性劑后形成的油包水的微小液滴。表面活性劑的極性端朝內,非極性端朝外,水溶液包在膠束內部。不管采用何種有機介質反應體系,酶催化反應的介質中都含有有機溶劑和一定量的水。( 6)在有機介質中,脂肪酶可以催化油脂與甲醇的酯交換反應,生成生物柴油。第八章酶定向進化思考題1. 酶定向進化: 是模擬自然進化的過程,在體外進行酶基因的人工隨機突變,建立突變基因文庫,在人工控制條件的特殊環(huán)境下,定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性酶的突變體的技術過程。酶定向進化的特點:1 適應面廣、目的性強、效果顯著。酶定向進
30、化的基本過程包括隨機突變、構建突變基因文庫、酶突變基因的定向選擇等步驟。2.易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時,通過調整反應條件, 如提高鎂離子濃度、加入鎰離子、改變體系中四種的 dNTPs濃度或運用低保真度 DNA聚合酶等,增加堿基配對錯誤的出現(xiàn)頻率,而引起 基因突變。通常,經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿意的結果,由此可以采反復多次易錯PCR方法。即將一次易錯PCRT增得到的正突變基因作為下一次易錯的模板,在進行易錯PCR如此反復進行,直至獲得較為滿意的結果為止。重排技術是從正基因突變文庫中分離得到的同源DNA用酶切割成隨機片段,經(jīng)過不加引物的多次 PCRf環(huán),使DNA的堿基序列重
31、新排布而引起基因突變的技術過程。DNA重排技術將兩條或多條正突變基因通過脫氧核糖核酸酶等酶的作用,隨機切割成若干DNA片段,然后將這些隨機片段在不加引物的條件下經(jīng)過多次PCRf環(huán),使這些 DNA!機片段互為模板和引物進行擴增、延伸,再加入適宜的引物進行PC或應,獲得全長的基因。經(jīng)過一次DNA1排獲得的突變基因往往未能達到人們的要求,為此,需要經(jīng)過構建突變文庫和篩選的過程,獲得的正突變基因在反復經(jīng)過上述步驟,直 到獲得所需的突變基因為止。4. 基因家族重排技術:是從基因家族的若干同源基因出發(fā),用酶切割成隨機片段,將經(jīng)過不加引物的多次PCRB環(huán),使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術過
32、程?;蚣易逯嘏偶夹g與 DNA重排技術的基本過程大致相同,都要經(jīng)過基因的隨機切割、無引物PCR等步驟以獲得突變基因,然后通過構建突變基因文庫、采用高通量篩選技術篩選獲得正突變基因?;蚣易逯嘏偶夹g與 DNAt排技術的主要不同點在于前者從基因家族的若干同源基因出發(fā)進行DNA序列的重新排布,而后者則從采用易錯 PC育技術所獲得的兩個以上的正突變基因出發(fā)進行DN際列的重新排布。其他內容: 體外隨機突變的技術主要有:易錯PC叱術、DNAt排技術、基因家族重排技術。易錯PC叱術所引起的基因突變和遺傳進化僅在單一分子內發(fā)生,所以屬于無性進化。DNA重排技術將存在于兩種或多種不同基因中的正突變結合在一起,通
33、過DNA堿基序列的重新排布,形成新的突變基因,屬于用性進化。突變基因文庫的構建是將各種不同的突變基因與載體重組,再轉入適宜的細胞或包裝成重組入噬菌體的技 術過程。構建突變基因文庫的過程主要包括載體的選擇、基因重組、形成基因文庫等。高通量篩選技術包括:平板篩選法、熒光篩選法、噬菌體表面展示法、酵母細胞面展示法。第九章酶反應器的類型:攪拌罐式反應器,鼓泡式反應器,填充床式反應器,流化床式反應器,膜反應器選擇酶反應器的主要依據(jù)有:根據(jù)酶的應用形式選擇;根據(jù)酶反應動力學性質選擇;根據(jù)底物或產(chǎn)物的理化性質選擇;其他影響因素:所選擇的反應器應當能夠適用于多種酶的催化反應,并能滿足酶催化反應所需的條件,并可進行適當?shù)恼{節(jié)控制。酶反應器設計的主要內容:反應器類型的選擇,反應器制造材料的選擇,熱量衡算,物料衡算酶反應器的操作過程中要注意的問題:保持酶反應器的操作穩(wěn)定性;防止酶的變性失活
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