高效液相色譜法培訓(xùn)PPT

1、關(guān)于高效液相色譜法培訓(xùn)第一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月高效液相色譜法（HPLC）是60年代末以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論與實驗方法，流動相用高壓泵輸送，采用高效固定相和在線檢測等手段發(fā)展而成的分離分析方法 。與氣相色譜法相比具有：適用范圍廣，樣品預(yù)處理簡單，分離效率高，流動相選擇范圍廣，檢測方法多為非破壞性的，流出組分可回收等優(yōu)點。第一節(jié) 概述第二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC液-固吸附液-液分配正相色譜反相色譜一般反相色譜離子對色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜離子色譜氨基酸分析空間排斥色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜假相色譜膠束色

2、譜環(huán)糊精色譜親合色譜，手性色譜，毛細(xì)管電泳鍵合相色譜第三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月正相色譜（normal phase）流動相極性小于固定相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜。常用的分析柱有:氨基柱、氰基柱、硅膠柱。常用流動相為極性小的有機溶劑。反相色譜（reversed phase）流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法。常用的分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。常用流動相為甲醇-水，乙腈-水。第四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月離子抑制色譜（ion suppression chromatography）調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制組分的解離，

3、增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，以達(dá)到分離有機弱酸和弱堿的目的。離子對色譜（ion pair chromatography）將反離子加入流動相中，與呈解離狀態(tài)的被測物作用，生成脂溶性的中性離子對絡(luò)合物，從而增加了被測物在非極性固定相中的溶解度，改善分離效果，達(dá)到分離目的。常用反離子有：季銨鹽 用于酸類 烷基磺酸鹽用于堿類第五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月離子色譜法（ ion chromatography ）離子色譜是由經(jīng)典的離子交換色譜發(fā)展起來的一種液相色譜技術(shù)，利用物質(zhì)在離子交換柱上遷移的差異而達(dá)到分離，用于親水性陰陽離子的測定。根據(jù)是否采用抑制柱，可分為抑制型離子色譜和

4、非抑制型離子色譜。第六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月空間排斥色譜（steric exclusion ）也稱凝膠色譜，依據(jù)被分離組分分子尺寸與凝膠空徑大小之間的相對關(guān)系而分離，類似于分子篩作用。在一定分子線團(tuán)尺寸內(nèi)，分子越大，保留時間越短。凝膠滲透以有機溶劑為流動相凝膠過濾以水溶液為流動相對于相同化學(xué)組成的高分子化合物，其分子尺寸大小與分子量成正比，因此凝膠色譜可以研究高分子化合物的分子量分布。第七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月膠束色譜(micellar chromatography)表面活性劑在水中超過某一濃度（臨界濃度）時，多余的表面活性劑不再溶解，聚集而成膠束（

5、膠粒）。以膠束分散體系為流動相的色譜法稱為膠束色譜法。它的流動相為膠束多相分散體系，不是真溶液；流動相中不含有機溶劑。因膠束色譜法的流動相是多相分散體系，在整個色譜體系中又增加了一相，故也被稱為假相色譜（pseudo phase chromatography）。第八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月手性色譜(chiral chromatography)用于分離手性藥物對映體的一種有效技術(shù)，可分為直接法和間接法兩類：直接法手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)手性流動相法(chiral mobile phase additive;CMPA)間接法手性試劑

6、衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)第九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 高效液相色譜儀色譜柱進(jìn)樣閥流動相檢測器高壓泵脫氣裝置 第十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 第十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月溶劑 色譜泵自動進(jìn)樣器 HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖第十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月啟動液相色譜儀器的流程 開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源 打開泵、自動進(jìn)樣

7、器、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機啟動 色譜管理軟件準(zhǔn)備流動相 過濾，脫氣色譜泵排氣 用新配制的流動相灌注泵第十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月液相柱-保留值與pH的關(guān)系 pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流動相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6溫度： 50流速： 1.0mL/min.第十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 流動相類別 按流動相組成分：單組分和多組分 按極性分：極性、弱極性、非極性 按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫 第十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)

8、作于2022年6月對溶劑的要求水： 去離子水 自動純水儀純凈水 商品瓶裝水 溶劑: 色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑: 分析純第十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。 理想的HPLC用水應(yīng)為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。 第十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流

9、波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動 過濾與脫氣第十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相的保存有機溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機相的揮發(fā)選用適宜的容器第二十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相的保存有機溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用：

10、低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機相的揮發(fā)選用適宜的容器第二十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月1梯度洗脫的特點（1）改善分離, 加快分析速度；（2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上, 保持柱性能長期良好；（5）下次分析時, 流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異, 可能會引起基線漂移第二十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月2梯度洗脫的主要條件 A 流動相/弱溶劑組成； B 流動相/強溶劑組成； 梯度時間； 梯度曲線

11、：線性、凸型或凹型等。強溶劑 A%time125第二十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當(dāng)，梯度的準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)體積）設(shè)計合理第二十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸

12、送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器第二十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為24ml第二十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：

13、梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)第三十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月輸液泵多用柱塞往復(fù)泵，柱塞向前運動，液體輸出，流向色譜柱；向后運動，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運動，將流動相 源源不斷地輸送到色譜柱中。柱塞往復(fù)泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響，泵壓最高為400kg/cm2。這種泵具有清洗容易，更換流動相方便等優(yōu)點，但脈動性較大是其缺點。目前多采用雙泵補償法來克服這一問題。第三十一張，PPT共一百零

14、二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物，含強絡(luò)合劑的溶液等。過濾用濾膜過濾或垂熔漏斗過濾脫氣采用超聲或過濾的方法注意流動相使用前沖洗使用含酸、堿、緩沖液的流動相后，必須用不含鹽的有機溶劑-水沖洗！第三十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月進(jìn)樣閥第三十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月1

15、柱泵324定量圈進(jìn)樣孔6廢液5廢液Inject6柱泵3214定量圈進(jìn)樣孔廢液5廢液Load第三十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月注意：使用后應(yīng)清洗！第三十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月進(jìn)樣注意點進(jìn)樣閥的廢液出口端高度必須與進(jìn)樣針在同一水平位置，以免虹吸作用，使樣品向針筒方向回流，或從廢液口流出。使用前后，要用流動相（不含酸堿等緩沖液）或甲醇或水沖洗針孔，用針孔清洗器）。第四十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月進(jìn)樣方法整個定量圈體積進(jìn)樣為獲得好的精密度，進(jìn)樣量應(yīng)大于定量圈量的2-5倍以上。由于層流影響，需要有過量的樣品液來取代管壁上的流動相（見下圖）。Sa

16、mple Mobile phase第四十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月例20l定量圈，進(jìn)樣體積不能超過10 l。否則，部分樣品將會從出口流失。這是因為由于層流的關(guān)系，樣品流經(jīng)管中心的速度是平均速度的兩倍。進(jìn)樣前應(yīng)用流動相沖洗進(jìn)樣孔，以除去前一針留下的樣品。注射針必須清洗干凈。部分定量圈體積進(jìn)樣當(dāng)樣品量少時，采用部分體積進(jìn)樣，進(jìn)樣量由微量注射器手動控制，要求：不得超過定量圈體積的1/2量第四十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月檢測器紫外檢測器可變波長檢測器光電二極管陣列檢測器熒光檢測器電化學(xué)檢測器蒸發(fā)光散射示差檢測器質(zhì)譜第四十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年

17、6月色譜圖minH光譜圖nmAA-曲線(定性)A-t 曲線 (定量)第四十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月蒸發(fā)光散射檢測器是通用檢測器，適用于無紫外吸收的化合物。原理：組分先引入已通氣體（N2,空氣 ）的蒸發(fā)室，加熱，使流動相蒸發(fā)而被除去，樣品組分形成氣溶膠而產(chǎn)生光散射，測定散射光強度而獲得組分的濃度信號。 本法中流動相在檢測前已蒸發(fā)，故梯度洗脫基線穩(wěn)定。第四十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月組分的氣溶膠噴霧蒸發(fā)檢測N2光源溶劑泵色譜柱流出物注意：流動相必須是揮發(fā)性的，不能含緩沖鹽，若調(diào)節(jié)pH可用氨水、醋酸。第四十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)譜檢

18、測器第四十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月UV-VISDAD Flu Refra ElecConducotherMs檢測器使用統(tǒng)計第四十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系第四十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性第五十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月靈敏度：

19、信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N = 24定量限（LOQ）：S/N = 810好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性6:1NS第五十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月吸光度（Absorbance UV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大第五十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月吸光度檢測器（UV/Vis

20、） 優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm第五十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月吸光度檢測器（UV/Vis） 缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至

21、少510nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響第五十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1% TFA50% ACN with 0.1%

22、TFA第五十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C.流動相： A: 0.1% TFA in Water.B: 0.1% TFA in Acetonitrile.梯度： 5 - 40% B in 35 min.流速： 1.0 mL/min.樣品： 水（10 L inj. vol.）檢測： 214 nm 圖1；好的梯度系統(tǒng) 圖2；一般的二元梯度系統(tǒng) 圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)第五十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月為何如此重要？五個小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色

23、譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中。第五十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月基線噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffeine 271 nm第五十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱色譜柱有柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成，柱長1030cm，內(nèi)徑26mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。根據(jù)鍵合基團(tuán)極性不同，化學(xué)鍵合相可分為非極性、中等極性和極性三類。常用色譜柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等第五十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月非極性鍵合相表面基團(tuán)為非極性烴基，如C18 、C8等，主要用于RP色譜。 C18是最常用的非極性鍵合相，將十八烷

24、基氯硅烷與硅膠表面的硅醇基經(jīng)多步反應(yīng)而成。R1，R2 =H，Cl ， CH31（2，3）：1第六十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)R1、R2基團(tuán)，含碳量可分為高碳、中碳、低碳型鍵合相：高碳 R1=R2 =CH3 載樣量大，吸附性能大；中碳 R1=H, SiO Si(H) C18H37 R2 =Cl SiO 低碳 R1=R2 = Cl SiO SiO SiOSiC18H37第六十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月中等極性鍵合相常見的有醚基鍵合相，這類鍵合相根據(jù)流動相的極性，可作為正相或反相色譜的固定相，應(yīng)用較少。極性鍵合相可作正相或反相色譜使用氨基鍵合相： 硅膠-氨丙

25、硅烷基Si(CH2)3NH2 氰基鍵合相： 硅膠-氰乙硅烷基Si(CH2)2CN 鍵合相色譜pH控制在2-8第六十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月液相色譜的色譜柱第六十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱的連接 Stop_depth長度不合適造成柱前死體積 第六十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月錐箍錐度不合適造成滲漏 色譜柱的連接 第六十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱使用與保存所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱 色譜柱 柱體積 沖洗體積150 4.6m

26、m 2.5ml 50ml200 4.6mm 3.3ml 65ml250 4.6mm 4.2ml 80ml第六十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月保存色譜柱時用100%甲醇或乙腈，柱兩端必須用接頭密封。停用數(shù)天后最使用時，應(yīng)先用低流速甲醇沖洗1h左右，然后再換上流動相，否則直接用流動相，柱效會下降，峰形不好。 新柱使用前應(yīng)用甲醇或乙腈沖洗（0.5ml/min）。第六十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱失效癥狀色譜柱壓增高峰變寬，拖尾，裂峰塔板數(shù)下降，選擇性下降，分離度降低保留值減小或增大色譜柱失效的原因進(jìn)口濾片堵塞吸附了樣品雜質(zhì)柱填充不良，使用久，機械及熱沖擊造成空

27、洞固定相遭化學(xué)侵蝕第六十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月原因 壓力 拖尾 塔板數(shù) 選擇性 保留值堵塞 # # #空洞 # #吸附樣品 #化學(xué)沖擊 # # # #柱凹陷出現(xiàn)裂峰現(xiàn)象，填料與色譜柱頂端不齊平，可用相同填料填平凹陷處。壓力影響應(yīng)避免突然的壓力波動與任何的機械與熱力沖擊，如色譜柱掉在實驗臺上或驟然改變柱溫等。進(jìn)樣過程中轉(zhuǎn)動進(jìn)樣閥太慢引起壓力波動，會使色譜峰產(chǎn)生裂隙。第七十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月柱壓升高原因強保留樣品組分強吸附組分易聚集在柱進(jìn)口填料上，嚴(yán)重縮短色譜柱壽命。尤其是生物樣品提取物、含油成分等。當(dāng)嚴(yán)重拖尾峰出現(xiàn)時往往是強保留污染物在柱口處聚集

28、的信號。解決辦法使用保護(hù)柱可延長分析柱壽命。每天實驗后應(yīng)用強溶劑（例甲醇-水等，至少20-30倍柱體積的量）沖洗色譜柱。并定期進(jìn)行保養(yǎng)，以低流速的強溶劑較長時間沖洗色譜柱。第七十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品純度差有微小的顆粒堵塞管路。可用濾膜過濾樣品后再進(jìn)樣。樣品濃度高連續(xù)進(jìn)樣，造成過載。如果樣品吸收度不是太低，使樣品濃度在1mg/ml以下較適宜。 流動相中緩沖液濃度過高，有機相比例大在色譜過程中堵塞管路，析出的鹽結(jié)晶還磨損泵、進(jìn)樣閥密封圈造成漏液。緩沖液濃度一般控制在20mmol以下較適宜，測定完畢后必須及時用水充分沖洗。第七十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年

29、6月注意！ 一旦柱壓升高，應(yīng)停止測定，用水沖洗數(shù)小時或更長時間，待壓力下降后再測定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)逐級檢查，換泵頭上濾芯，保護(hù)柱等。第七十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月柱效低的原因頻繁更換流動相組成加速柱效降低。最好一根色譜柱使用的流動相成分和pH值相近，如始終在酸性條件下或堿性條件下工作。 色譜柱的選擇不合適或使用時間久更換色譜柱（廠家，型號）進(jìn)樣操作不當(dāng)轉(zhuǎn)動進(jìn)樣閥時應(yīng)一次轉(zhuǎn)到位，不能過慢或停頓，否則易造成裂峰。 第七十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品溶劑與流動相成分不匹配樣品溶劑與流動相成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如樣品用純甲醇作溶劑，而流動

30、相中甲醇比例很低，這樣易出現(xiàn)前沿峰，改變樣品溶劑成分或比例，使醇-水比例接近于流動相。前沿峰倒峰第七十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果不能重現(xiàn) 表現(xiàn)為同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣所得峰面積相差大，引起這種情況時，可從以下幾方面來查找原因：泵、進(jìn)樣閥、管路漏液造成峰面積變化。檢測器靈敏度改變?nèi)绻粯悠穬纱芜M(jìn)樣峰面積相差10倍或更大倍數(shù)，則最可能的原因是檢測器的靈敏度被無意中改變，軟件的靈敏度改變不會影響峰面積的積分?jǐn)?shù)值。第七十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜軟件積分方式是否一致尤其是對于色譜峰較復(fù)雜的，積分時基線稍有變化將造成峰面積大的變化，如果兩峰不是基線分離，則

31、峰切割方式對峰面積有很大影響，有時候采用峰高較峰面積誤差小。垂直切割基線切割第七十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品溶液的穩(wěn)定性 有些樣品在流動相條件下不穩(wěn)定，放置后會產(chǎn)生雜質(zhì)峰，應(yīng)注意。例如有一樣品在流動相溶液中不穩(wěn)定，配制后于不同時間進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)在主峰后會產(chǎn)生一雜質(zhì)峰，該雜峰隨時間而迅速增大。將流動相中緩沖液換成水后，樣品測定液放置15h后仍穩(wěn)定。第七十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC 法在藥物分析中的應(yīng)用鑒別采用標(biāo)準(zhǔn)品對照法檢查中國藥典規(guī)定了5種測定方法含量測定中國藥典規(guī)定了2種定量方法在進(jìn)行HPLC測定時，中國藥典規(guī)定要進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗第七十九張，

32、PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月系統(tǒng)適用性試驗柱效 n=5.54(tR/Wh/2)2分離度 R=拖尾因子 T=重復(fù)性 取對照品或樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD應(yīng)小于2.0%2(tR2-tR1)W1+W2W0.05h2d1(R 1.5)(T=0.951.05)其中分離度和重復(fù)性是更具實際意義的參數(shù)(ChP.2005)第八十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月定量分析方法內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)物要求：樣品中不含有的組分。保留時間與待測物相近，但分離度R1.5。（理化性質(zhì)相近）有足夠的純度。 第八十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月外標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)對照法 C樣=A樣

33、/ A標(biāo) C標(biāo)第八十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月83日常維護(hù)和常見色譜故障溶劑及樣品的準(zhǔn)備 過濾溶劑的目的濕防止固體顆粒損傷儀器或柱頭；未經(jīng)過濾的溶劑或者溶劑瓶中生長微生物，都會降低溶劑入口過濾頭的壽命，并影響泵的性能，一般要求兩天過濾一次。 注意：過濾水相或有機相應(yīng)該選用不同的濾膜聚四氟乙烯幾乎可以過濾所有的溶劑、酸和堿尼龍66可以和大多數(shù)的有機物、水相容，但是建議不要用于強酸、二氯甲烷和DMF纖維素濾膜用于水相第八十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月84溶劑脫氣的方法氦氣脫氣真空脫氣回流加熱脫氣超身脫氣（最為常用）避免使用的溶劑鹵化物堿金屬溶液及相應(yīng)的酸溶液高

34、濃度的無機酸如硝酸、硫酸能形成自由基的試劑及其混合物四氯化碳和異丙醇或THF混合液含強絡(luò)合劑的溶液 第八十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月85色譜柱的平衡為了確保分析結(jié)果的再現(xiàn)性，對于反相柱應(yīng)使用510倍柱體積的流動相平衡色譜柱。注意：新裝到系統(tǒng)的色譜柱需要進(jìn)行初始化。先斷開柱子和檢測器間的管路，用流動相將色譜柱中的原有流動相或氣泡移出色譜柱，然后再將色譜柱和檢測器間的管路接好。第八十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月86保護(hù)色譜柱過濾所有的溶劑和樣品使用保護(hù)柱儀器使用完畢，要沖洗整個系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中緩沖液柱子不使用時，兩端密封注意柱子使用的pH范圍不要高壓沖洗柱子，

35、不要高溫下過長時間的使用硅膠鍵合相第八十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月87常見色譜故障基線噪音可能的原因檢測池臟檢測器燈能量下降由泵引起的脈沖檢測器上的溫度效應(yīng)檢測池中有氣泡通過第八十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月88常見色譜故障基線漂移可能原因梯度洗脫引起流動相臟柱子沒平衡系統(tǒng)中污染物溢出RID檢測器溫度不穩(wěn)定第八十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月89常見色譜故障鬼峰鬼峰沒有進(jìn)樣就有色譜峰出現(xiàn)原因流動相臟，尤其是水相常見色譜故障雙峰柱頭塌陷或柱床運動泵頭過濾芯部分堵塞組分共流出第八十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月90常見色譜故障壓

36、力過高可能原因柱子進(jìn)口過濾芯被污染Purge閥過濾芯被污染色譜柱被污染連接管路堵塞進(jìn)樣器旋轉(zhuǎn)密封閥被堵塞進(jìn)樣針或者針座被堵塞可用分段法來檢查哪一段發(fā)生堵塞第九十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月91常見色譜故障壓力過低溶劑進(jìn)口過濾芯被堵連接管路泄漏或其他備件泄漏溶劑或流速的改變主動閥失靈四元比例閥失靈單向出口閥失靈柱子失效（固定相流失）第九十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月92常見色譜故障壓力波動可能原因溶劑進(jìn)口過濾芯堵塞溶劑未脫氣泵的密封圈老化出口單向閥失效主動閥失效最常見的原因失泵內(nèi)有七寶第九十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月維護(hù)流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進(jìn)樣器檢測器第九十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月吸