流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展

1、流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第1頁 內(nèi)容病毒性滅活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生產(chǎn)工藝33流感疫苗研發(fā)44.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第2頁病毒性滅活疫苗概述定義及分類病毒接種和培養(yǎng)采取物理或化學(xué)方式將病毒滅活其它生產(chǎn)步驟成品培養(yǎng)基質(zhì)流感疫苗：雞胚出血熱及森腦疫苗：原代地鼠腎細(xì)胞狂犬疫苗：Vero 細(xì)胞滅活方法：加熱滅活劑（福爾馬林等）純化：純化全病毒疫苗裂解：裂解疫苗亞單位：亞單位疫苗純化全病毒疫苗：凍干人用狂犬病疫苗出血熱、森腦-含氫氧化鋁佐劑裂解：流感病毒裂解疫苗滅活疫苗：稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)完整病原微生物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持

2、免疫原性，并結(jié)合對(duì)應(yīng)佐劑而制成疫苗。.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第3頁長春企業(yè)病毒性滅活疫苗 工藝流程名稱病毒培養(yǎng)病毒純化病毒裂解病毒滅活半成品配制及分包裝凍干人用狂犬病疫苗基質(zhì)：Vero細(xì)胞培養(yǎng)方式：生物反應(yīng)器超濾濃縮；柱層析（分子篩）無滅活劑：-丙內(nèi)酯凍 干雙價(jià)腎綜合征出血熱疫苗森林腦炎滅活疫苗基質(zhì)：原代地鼠腎細(xì)胞方式：轉(zhuǎn)瓶超濾濃縮；柱層析（分子篩）無滅活劑：甲醛含鋁佐劑流感病毒裂解疫苗基質(zhì)：雞胚方式：孵化間超濾濃縮；蔗糖密度區(qū)帶離心裂解劑：Triton X-100滅活劑：甲醛無硫柳汞.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第4頁兩種滅活劑比較簡明介紹滅活機(jī)理優(yōu)缺點(diǎn)甲醛甲醛，化學(xué)式HCHO，稱蟻醛。無色氣體，

3、有特殊刺激氣味，對(duì)人眼、鼻等有刺激作用。既可作用于病毒含氨基核苷酸堿基（如A,G,U），又可作用病毒殼蛋白。1）病原體蛋白抗原性嚴(yán)重破壞，可能有病原體存活；2）滅活時(shí)間長；3）易受溫度、pH、濃度、是否存在有機(jī)物、病原體種類和含氮量等原因影響；4）殘留游離甲醛，注入機(jī)體后，會(huì)產(chǎn)生制激性反應(yīng)。-丙內(nèi)酯一個(gè)雜環(huán)類化合物(C3H4O2)，沸點(diǎn)155，常溫下是無色粘稠狀液體，對(duì)病毒含有很強(qiáng)滅活作用。作用于病原體DNA或RNA，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)抵達(dá)滅活目標(biāo)，而不直接作用于蛋白。1）不破壞病毒血凝素抗原, 保持病毒良好免疫原性；2）滅活時(shí)間短；3）其水解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無害，接種反應(yīng)輕。.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展

4、第5頁常見裂解劑簡明介紹機(jī)理Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一個(gè)非離子型表面活性劑（或稱去污劑）它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜通透性。Triton N-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一個(gè)非離子型表面活性劑（或稱去污劑）溶解脂質(zhì)CTAB十六烷基三甲基溴化銨,陽離子表面活性劑，是一個(gè)陽離子去污劑與非離子及兩性離子表面活性劑有良好配位性，對(duì)各種油脂具很好乳化作用, 有輕微脫脂作用.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第6頁流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分別引發(fā)急性呼吸道傳染病。常造成不一樣程度流行，對(duì)人類健康造成巨大威脅。慢性病惡化、繼發(fā)感染

5、、其它- 痛苦不堪- 缺課或缺勤- 就醫(yī)- 使用抗生素- 住院- 死亡流感流感和流感病毒.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第7頁流感流行特點(diǎn)是在短期內(nèi)突然發(fā)生，快速蔓延，造成不一樣程度流行，包含世界大流行，局部暴發(fā)流行及散發(fā)。含有一定季節(jié)性：溫、寒帶地域常在冬、春季節(jié)流行，但熱帶和亞熱帶地域任何季節(jié)都能夠流行。流感病毒傳輸快速、流行廣泛、抗原易變異，人群特異性免疫情況不穩(wěn)定。發(fā)病率高，并伴有一定死亡率。最高為青少年，高危人群為年邁體弱或帶有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中總要造成不一樣程度超額死亡。流感患者和隱性感染者是流感主要傳染源。從潛伏期末到發(fā)病急性期（約7天）都有傳染性。死亡率升高超出一定正

6、常臨界水平.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第8頁流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu).流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第9頁流感病毒超細(xì)微結(jié)構(gòu)照片流感病毒電鏡照片流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu).流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第10頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第11頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第12頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第13頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第14頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第15頁 甲型流感病毒基因組各節(jié)段大小與功效 節(jié)段 長度（bp）編碼蛋白 主要功效RNAI 2341 PB2 RNA轉(zhuǎn)錄酶；識(shí)別和結(jié)合起源于宿主細(xì)胞帽子RNA2 2320 PB1 RNA轉(zhuǎn)錄酶主要成份；開啟轉(zhuǎn)錄和RNA合成延伸RNA3 2233 PA 含有解旋酶話性RNA4

7、1778 HA 結(jié)合靶細(xì)胞受體，誘導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞融合誘導(dǎo)中 和抗體，凝集紅細(xì)胞RNA5 1565 NP 與基因組RNA結(jié)合，參加形成核糖核蛋白（RNP） 顆粒RNA6 1413 NA NA活性；水解細(xì)胞多糖受體，幫助新生病毒顆 粒從被感染宿主細(xì)胞表面游離下來，促使子代病 毒釋放RNA7 1027 M1、M2 病毒基質(zhì)膜蛋白，有保護(hù)作 用；質(zhì)子通道作用RNA8 890 NS1、NS2 非結(jié)構(gòu)蛋白，抑制宿主細(xì)胞蛋白合成或參加 vRNA合成.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第16頁 流感病毒理化特征 流感病毒對(duì)熱敏感，通常5630min被滅活，但有些毒株5690min被滅活。 最適PH為7.0-8.0可被紫外

8、線滅活因其為帶囊膜病毒，故對(duì)乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑敏感。.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第17頁流感病毒變異原因：流感病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)天然宿主廣泛存在親密接觸方式： 抗原漂移（Antigenic drift） -小變異，同一亞型 -基因點(diǎn)突變所致 -引發(fā)流行抗原轉(zhuǎn)換（Antigenic shift） -大變異 -基因片段交換 -引發(fā)大流行.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第18頁抗原漂移（Antigenic Drift）RNASialic acidAntibodiesHemagglutininNeuraminidaseHA 和/或 NA 基因點(diǎn)變異 頻繁發(fā)生 A 型和B型發(fā)生.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第19頁抗原

9、轉(zhuǎn)換（Antigenic shift)人類和動(dòng)物毒株RNA發(fā)生交換 (HA 和/或NA基因全球性變異),造成新亞型出現(xiàn) 少見但后果嚴(yán)重 只在 A型出現(xiàn) .流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第20頁1918194019601980H1N1H2N2H3N2H1N1H1N11918Spanish Influenza H1N11957Asian Influenza H2N21968Hong Kong Influenza H3N2Novel Influenza H1N1 H7 19801985199519751996 H51997 H91999流感流行情況.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第21頁抗原漂移所引發(fā)歷史上流感流行

10、 PB1HANAPB1NA.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第22頁N Engl J Med 10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒4種不一樣起源基因 4 different genes:北美豬流感病毒 North America swine歐亞豬流感病毒 Asia/Europe swine人流感病毒 Human influenza禽流感病毒 (非H5) Avian (Non-H5).流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第23頁流感試驗(yàn)室診療.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第24頁 流感已成為全球患病人數(shù)最多一類疾病。接種流感疫苗是當(dāng)前預(yù)防和控制流感最經(jīng)濟(jì)、最有效伎倆，已被廣泛采取，并證實(shí)有效率到達(dá)

11、70以上。流感疫苗.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第25頁 當(dāng)前，使用流感疫苗是三價(jià)，包含兩種甲型（H1N1，H3N2）和一個(gè)乙型(B)流感病毒抗原成份，應(yīng)用最廣泛有： 滅活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 減毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49歲 當(dāng)前主要應(yīng)用疫苗種類.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第26頁 滅活疫苗種類和生產(chǎn)工藝全病毒疫苗 裂解疫苗 亞單位疫苗第一代全病毒價(jià)格較低，但副反應(yīng)較高，個(gè)他人群不宜接種，已逐步淘汰第二代裂解接種效果好，臨床副反應(yīng)較少，適合各年紀(jì)段人群接種第三代亞單位有效抗原含

12、量高，更安全，價(jià)格較高滅活疫苗種類.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第27頁3-4月份10-11月份WHO公布毒株生產(chǎn)企業(yè)取得和培育毒株疫苗生產(chǎn)銷售每年世界衛(wèi)生組織依據(jù)上一年流感病毒流行情況預(yù)測(cè)下一年度流感病毒流行株并向各生產(chǎn)企業(yè)公布從WHO合作試驗(yàn)室取得病毒疫苗株，并將病毒在雞胚內(nèi)培養(yǎng)，制備毒種將病毒接種到雞胚內(nèi)培養(yǎng)，收獲尿囊液，經(jīng)純化、滅活、裂解后制備成疫苗2月份9月份5-9月份12-第二年4月9月-第二年2月份5月-9月生產(chǎn)周期5-6個(gè)月生產(chǎn)工藝.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第28頁生產(chǎn)工藝.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第29頁單價(jià)原液制備.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第30頁毒種和病毒尿囊液制備毒種MOI接種量溫

13、濕度培養(yǎng)時(shí)間通風(fēng)溫度時(shí)間顏色量.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第31頁選胚.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第32頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第33頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第34頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第35頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第36頁接種.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第37頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第38頁培養(yǎng).流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第39頁收獲.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第40頁純化.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第41頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第42頁裂解.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第43頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第44頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第45頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第46頁.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第47頁.

14、流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第48頁產(chǎn)品名稱檢定項(xiàng)目藥典標(biāo)準(zhǔn)主代種子無菌檢驗(yàn)無菌生長血凝滴度不低于1：320支原體檢驗(yàn)符合要求判別試驗(yàn)采取交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml外源性禽白血病病毒檢測(cè)陰性外源性禽腺病毒檢測(cè)陰性工作種子無菌檢驗(yàn)無菌生長血凝滴度不低于1：320支原體檢驗(yàn)符合要求判別試驗(yàn)采取交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml質(zhì)量控制.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第49頁中間產(chǎn)品質(zhì)量控制中間品檢定項(xiàng)目長春企業(yè)企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)病毒收獲液微生物程度105CFU/ml沙門氏菌陰性血凝滴度1:160細(xì)菌內(nèi)毒素10EU/ml蛋白含量3.5m

15、g/ml病毒濃縮液蛋白含量10mg/ml細(xì)菌內(nèi)毒素160EU/ml病毒純化液蛋白含量2.0mg/ml病毒裂解純化液蛋白含量0.5mg/ml病毒滅活純化液細(xì)菌內(nèi)毒素0.2EU/ugHA滅活驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求微生物程度10CFU/ml.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第50頁單價(jià)病毒原液質(zhì)量控制單價(jià)病毒原液檢定項(xiàng)目長春企業(yè)企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)判別試驗(yàn)抗原性與推薦病毒株相一致血凝素含量90ug/ml蛋白含量不高于血凝素含量4.0倍無菌檢驗(yàn)符合要求病毒裂解效果檢驗(yàn)病毒顆粒應(yīng)裂解完全。每次更換流感病毒毒株后生產(chǎn)前三批單價(jià)病毒液須進(jìn)行該項(xiàng)檢驗(yàn)。.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第51頁一些病毒能夠與人或動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這稱之為紅細(xì)

16、胞凝集反應(yīng)（HA）。這種凝集反應(yīng)被加入特異性血清所抑制，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）。血凝和血凝抑制試驗(yàn).流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第52頁血凝和血凝抑制試驗(yàn).流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第53頁 血凝素含量檢測(cè)（單擴(kuò)）.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第54頁標(biāo)準(zhǔn)直線.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第55頁半成品質(zhì)量控制半成品檢定項(xiàng)目長春企業(yè)企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)無菌檢驗(yàn)符合要求血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量應(yīng)為配制量80%120%裂解劑殘留量150ug/ml.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第56頁成品檢測(cè)指標(biāo)成品檢定項(xiàng)目長春企業(yè)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)判別試驗(yàn)抗原性與推薦病毒株相一致外觀微乳白色液體，無異味裝量應(yīng)不低于標(biāo)示量pH值6.8

17、7.8血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量應(yīng)為配制量80%120%游離甲醛含量50ug/ml卵清蛋白含量100ng/ml總蛋白含量350ug/ml,不高于血凝素總含量3.5倍細(xì)菌內(nèi)毒素20EU/ml抗生素殘留量50ng/劑無菌檢驗(yàn)符合要求異常毒性檢驗(yàn)符合要求.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第57頁當(dāng)前廣泛應(yīng)用流感疫苗季節(jié)性四價(jià)流感疫苗細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗噴鼻減毒活疫苗基因工程流感疫苗病毒樣顆粒、病毒載體及DNA流感疫苗通用流感疫苗研發(fā)與展望.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第58頁疫苗效果影響原因.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第59頁 接種疫苗是當(dāng)今預(yù)防和控制流感發(fā)生和流行最有效伎倆。當(dāng)前，使用流感疫苗是三價(jià)，包含

18、兩種甲型（H1N1，H3N2）和一個(gè)乙型(B)流感病毒抗原成份，應(yīng)用最廣泛有： 滅活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 減毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49歲當(dāng)前廣泛應(yīng)用流感疫苗.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第60頁多年獲批上市新型流感疫苗充實(shí)一下新型流感疫苗表疫苗種類商品名廠家同意地批按時(shí)間劑量對(duì)象備注佐劑疫苗Fluad Novartis 歐洲199765YMF59/AS03皮內(nèi)注射疫苗Intanza/ IDflu Sanofi Pasteur歐洲9g/株15g/株18-59Y60Y高劑量疫苗

19、Fluzone Sanofi Pasteur美國60g/株65Y細(xì)胞培養(yǎng)疫苗Influvac TCSolvay Pharmaceuticals Inc 荷蘭MDCKOptaflu Novartis 歐洲亞單位18YMDCKFlucelvaxNovartis美國亞單位18YMDCKCeltura Novartis歐洲H1N1pdm09亞單位MF59Celvapan Baxter歐洲H1N1pdm09全病毒6MVEROPreflucel Baxter美國裂解18-49YVERO重組HA疫苗FluBlok Protein Science 45g/株18-49Y.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第61頁 198

20、5年后在全球流行原單一譜系B型流感病毒BYamagata，逐步演變?yōu)槎N抗原性截然不一樣BVictoria和BYamagata二個(gè)譜系交替或者一個(gè)譜系為主混合流行。這二個(gè)譜系B型病毒之間極少或者沒有交叉保護(hù)甲型和乙型流感病毒血凝素基因進(jìn)化樹四價(jià)流感疫苗背景.流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展第62頁批按時(shí)間同意單位生產(chǎn)廠家疫苗名稱疫苗類型使用方式適用人群02月美國FDA阿斯利康旗下子企業(yè)MedImmuneFluMist Quadrivalent vaccine減毒活疫苗鼻腔噴霧2-49歲12月美國FDA葛蘭素史克企業(yè)Fluarix裂解疫苗肌肉注射3歲以上08月美國FDA葛蘭素史克企業(yè)FluLaval Quadrivalent裂解疫苗肌肉注射3歲以上06月美國FDA賽諾菲巴斯德企業(yè)Fluzone Quadrivalent裂解疫苗肌肉注射6個(gè)月以上12月歐盟阿斯利康企業(yè)Flu