酶工程緒論課件

1、1酶工程生物技術(shù)的四大支柱蛋白質(zhì)工程抗體工程糖鏈工程海洋生物技術(shù)生物轉(zhuǎn)化2核心和關(guān)鍵是主導(dǎo)技術(shù)基 礎(chǔ)條 件獲得產(chǎn)物的手段第二代基因工程第三代生物技術(shù)衍生工程技術(shù)3基因工程：用“剪刀+糨糊”創(chuàng)造新物種的工程。細(xì)胞工程：有生命的微型加工廠。酶工程：讓工廠高效、安靜、美麗如畫的工程。發(fā)酵工程：把微生物或細(xì)胞造就成無數(shù)微型工 廠，將神話變?yōu)楝F(xiàn)實的橋梁。5化學(xué)酶工程（初級酶工程） 酶化學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。 主要研究內(nèi)容：酶的制備、酶的分離純化、酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)、酶分子修飾、酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用。2. 生物酶工程（高級酶工程） 在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來的、酶學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物

2、。 6生物酶工程示意圖酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能新酶分子藍(lán)圖選擇性修飾方案突變酶 新酶克隆酶產(chǎn)品效用發(fā)展酶基因遺傳設(shè)計遺傳修飾DNA重組技術(shù)DNA重組技術(shù)7 生物酶工程主要研究內(nèi)容（1） 用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治療血栓病的有效藥物。用DNA重組技術(shù)將人尿激酶原的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，可使大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)人尿激酶原，從而取代從大量的人尿中提取尿激酶。（2）用蛋白質(zhì)工程技術(shù)定點改變酶結(jié)構(gòu)基因（突變酶）如：酪氨酰tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的絲氨酸），使該酶對底物ATP的親和力提高了100倍。（3）設(shè)計新的酶結(jié)構(gòu)基因，生產(chǎn)自然界從

3、未有過的性能穩(wěn)定、活性更高的新酶。8酶工程內(nèi)容 1971年第一屆國際酶工程會議，將酶生產(chǎn)與應(yīng)用確認(rèn)為酶工程核心內(nèi)容：（1）酶的產(chǎn)生（天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)）；（2）酶的分離純化及鑒定技術(shù)；（3）酶的固定化技術(shù)（酶和細(xì)胞固定化）；（4）酶分子的定向改造與修飾（5）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用；（6）酶的應(yīng)用。10人們對酶的認(rèn)識起源于生產(chǎn)與生活實踐。夏禹時代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國時期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。酶者，酒母也二、酶工程研究歷史與現(xiàn)狀不自覺的應(yīng)用：釀酒、造醬、制飴糖、治病酶學(xué)的產(chǎn)生: 消化與發(fā)酵現(xiàn)象（一）酶學(xué)研究簡史12發(fā)酵1684年，比利時醫(yī)生He

4、lment提出 ferment引起釀酒過程中物質(zhì)變化的因素（酵素）。1833年，法國化學(xué)家Payen (佩恩)和Person(帕索茲) 用酒精處理麥芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。1878年，德國科學(xué)家Khne(庫尼)提出 enzyme從活生物體中分離得到的酶，意思是“在酵母中”（希臘文）。14Buchner試驗： 用細(xì)砂研磨酵母細(xì)胞，壓取汁液，汁液不含活細(xì)胞，但仍能使糖發(fā)酵生成酒精和二氧化碳。證明：發(fā)酵與細(xì)胞的活動無關(guān)。1516 酶活細(xì)胞產(chǎn)生的，能在細(xì)胞內(nèi)外起作用的（催化）生理活性物質(zhì)。enzymeorganic chemical substance (a catalyst) fo

5、rmed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself. 酶的化學(xué)本質(zhì)？17 酶學(xué)的迅速發(fā)展（理論研究）（1） 酶的化學(xué)本質(zhì)1926年,美國康乃爾大學(xué)的“獨臂學(xué)者” Sumner（薩姆納）博士從刀豆中提取出脲酶結(jié)晶，并證明具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。并獲得1947年的諾貝爾獎。1930年，美國的生物化學(xué)家Northrop分離得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）結(jié)晶，確立了酶的化學(xué)本質(zhì)。1820（2） 酶學(xué)理論研究1

6、890年，F(xiàn)isher鎖鑰學(xué)說。1902年，Henri中間產(chǎn)物學(xué)說。1913年， Michaelis 和 Menten米氏學(xué)說。1958年， Koshland誘導(dǎo)契合學(xué)說。1960年，Jacob 和 Monod操縱子學(xué)說。21 酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)。 是否所有的酶都是蛋白質(zhì)？ 1982年，Thomas R.Cech(切克)等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞的26S rRNA前體具有自我剪接功能，將這種具有催化活性的天然RNA稱為核酶Ribozyme。 1986年，Schultz 等以過渡態(tài)類似物為半抗原，獲得了具有催化活性的抗體，即抗體酶（abzyme）23（二) 酶工

7、程研究簡史（應(yīng)用研究）1894年，日本的高峰讓吉用米曲霉制備得到淀粉酶，開創(chuàng)了酶技術(shù)走向商業(yè)化的先例。1908年，德國的Rohm用動物胰臟制得胰蛋白酶，用于皮革的軟化及洗滌。1908年，法國的Boidin制備得到細(xì)菌淀粉酶，用于紡織品的褪漿。1911年，Wallerstein從木瓜中獲得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。 20世紀(jì)前幾十年，酶蛋白的研究技術(shù)沒有突破，酶工程研究進(jìn)展緩慢。24 第二次世界大戰(zhàn)以后，隨著微生物培養(yǎng)技術(shù)、發(fā)酵工業(yè)和設(shè)備的漸漸完善，利用微生物來獲得商品化酶制劑已形成規(guī)模化產(chǎn)業(yè)，并開辟了廣闊的市場。 26自然酶在工業(yè)應(yīng)用上受到限制的原因主要有：大多數(shù)酶脫離其生理環(huán)境后極不穩(wěn)定，

8、而酶在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中的條件往往與其生理環(huán)境相去甚遠(yuǎn)；酶的分離純化工藝復(fù)雜；酶制劑成本較高27固定化酶較自由酶具有很多優(yōu)點：穩(wěn)定性高；酶可反復(fù)使用；產(chǎn)物純度高，副產(chǎn)物少，從而有利提純；生產(chǎn)可連續(xù)化、自動化；設(shè)備小型化，節(jié)約能源等。28固定化酶的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展固定化細(xì)胞技術(shù)近年來，后來居上的固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)展更為迅速，在實際應(yīng)用方面已大大超過固定化酶。在工業(yè)應(yīng)用方面，利用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)酒精、啤酒的研究較引入注目。日本Toshio Onaka 等用海藻酸鈣凝膠包埋酵母細(xì)胞，可在一天內(nèi)獲得質(zhì)量優(yōu)良的啤酒。法國Corriell 等將酵母細(xì)胞固定在聚氯乙烯碎片和多孔磚等載體上進(jìn)行啤酒發(fā)酵中型試驗

9、，可連續(xù)運轉(zhuǎn)8個月。中國上海工業(yè)微生物研究所等單位也從20世紀(jì)70年代后期進(jìn)行過類似的研究工作，用固定化酵母發(fā)酵啤酒的規(guī)模不斷擴(kuò)大，已正式投入大規(guī)模生產(chǎn)。 10因此固定化酶研究仍是酶工程研究的中心304 通常將改變酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的過程稱為改造，而將酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的共價變化稱為修飾。 酶分子經(jīng)加工改造后，可導(dǎo)致有利于應(yīng)用的許多重要性質(zhì)與功能的變化。如德重等利用蛋白水解酶的有限水解作用，已將L-天冬氨酸酶的活力提高36倍。 美國Davis等人還利用蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾作用，研究降低或解除異體蛋白的抗原性及免疫原性。以聚乙二醇修飾治療白血病的特效藥L-天冬酰胺酶，使其抗原性完全解除。1131 基因工

10、程與酶工程相結(jié)合 1980年，Wagner等人報道，將大腸桿菌ACTT11105的青霉素酰化酶基因克隆到質(zhì)粒上，獲得產(chǎn)酶活力更高的大腸桿菌5K(PHMl2)雜交株，并將此大腸桿菌雜交株固定，用于生產(chǎn)青霉素酰化酶。這是基因工程與酶工程相結(jié)合的第一例。 近年來，有關(guān)藻類等各種植物細(xì)胞、原生動物等各種動物細(xì)胞固定化研究十分活躍。1980年，Lim和Sun報道，用海藻酸鈣包埋胰島細(xì)胞可用于大白鼠糖尿病的治療研究。32 20世紀(jì)90年代，隨著基因工程的廣泛介入，一些原來只能由動物或植物生產(chǎn)的酶，經(jīng)過酶基因重組，可以在微生物上表達(dá)。由于在發(fā)酵過程中很容易對微生物進(jìn)行控制，因此 “基因工程發(fā)酵工藝先進(jìn)的發(fā)酵

11、設(shè)備”可以算是酶工業(yè)的第三次飛躍。 33 從酶工程的進(jìn)展和動態(tài)中可以預(yù)料，今后將會出現(xiàn)一批基因工程表達(dá)的酶制劑，親和層析技術(shù)仍將得到廣泛應(yīng)用，并會出現(xiàn)一個應(yīng)用經(jīng)分子改造與修飾的酶制劑的熱潮。異體酶的抗原性將得到解決。在酶活性的控制方面將會有較大突破，其中酶抑制劑與激活劑仍將受到極大重視，并在臨床及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。在化學(xué)合成工業(yè)中，酶法生產(chǎn)將有重大貢獻(xiàn)，模擬酶、酶的人工設(shè)計合成、抗體酶、雜交酶將成為活躍的研究領(lǐng)域。非水系統(tǒng)酶反應(yīng)技術(shù)(反向膠束中的酶促反應(yīng)、有機(jī)溶劑中的酶反應(yīng))也仍將是研究熱點之一。1334三、酶工程現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中的地位 其應(yīng)用范圍越來越廣。除應(yīng)用于傳統(tǒng)的食品工業(yè)(乳

12、糖的分解、乳酪制造、牛奶消毒、酒精生產(chǎn)等)外，在其他領(lǐng)域如工業(yè)催化劑、分析化學(xué)、醫(yī)療、篩選活性物質(zhì)、新能源、污水處理、親和層析等也獲得廣泛應(yīng)用。35“綠色健康”，“酶”力無限醫(yī)藥、洗滌劑、紡織、淀粉制糖、發(fā)酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒釀造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、飼料、皮革、造紙和化工等工業(yè)領(lǐng)域 酶工程在現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中的地位361、酶在醫(yī)藥方面的應(yīng)用2、酶在食品方面的應(yīng)用3、酶在輕工、化工方面的應(yīng)用 4、酶在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用GoGoGoGo5、酶在生物技術(shù)方面的應(yīng)用Go37酶在醫(yī)藥方面的應(yīng)用用酶進(jìn)行疾病的診斷用酶進(jìn)行疾病的治療用酶制造各種藥物381-1 通過酶活力

13、變化進(jìn)行疾病診斷酶疾病與酶活力變化淀粉酶胰臟疾病，腎臟疾病時升高；肝病時下降膽堿酯酶肝病、肝硬化、有機(jī)磷中毒、風(fēng)濕等，活力下降酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、紅血球病變時，活力升高堿性磷酸酶佝僂病、軟骨化病、骨瘤、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)時，活力升高；軟骨發(fā)育不全等，活力下降谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（-GT）原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌，活力增高至200單位以上，阻塞性黃疸、肝硬化、膽道癌等，血清中酶活力升高醛縮酶急性傳染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力顯著升高胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指腸潰瘍，活力下降磷酸葡糖變位酶肝炎、癌癥，活力升高乳酸脫氫酶肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力顯

14、著升高；肝硬化，活力正常端粒酶癌細(xì)胞中含有端粒酶，正常體細(xì)胞內(nèi)沒有端粒酶活性山梨醇脫氫酶（SDH）急性肝炎，活力顯著提高脂肪酶急性胰腺炎，活力明顯增高，胰腺癌、膽管炎患者，活力升高肌酸磷酸激酶（CK）心肌梗塞，活力顯著升高；肌炎、肌肉創(chuàng)傷，活力升高羥基丁酸脫氫酶心肌梗塞、心肌炎，活力增高磷酸己糖異構(gòu)酶急性肝炎，活力極度升高；心肌梗塞、急性腎炎，腦溢血，活力明顯升高鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明顯升高乳酸脫氫酶同工酶心肌梗塞、惡性貧血，LDH1增高；白血病、肌肉萎縮，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌，LDH3增高；轉(zhuǎn)移性肝癌、結(jié)腸癌，LDH4增高；肝炎、原發(fā)性肝癌、

15、脂肪肝、心肌梗塞、外傷、骨折，LDH5增高葡萄糖氧化酶測定血糖含量，診斷糖尿病亮氨酸氨肽酶（LAP）肝癌、陰道癌、阻塞性黃疸，活力明顯升高391-2 用酶測定物質(zhì)的量的變化進(jìn)行疾病診斷 酶測定的物質(zhì)用 途葡萄糖氧化酶葡萄糖測定血糖、尿糖，診斷糖尿病葡萄糖氧化酶+過氧化物酶葡萄糖測定血糖、尿糖，診斷糖尿病尿素酶尿素測定血液、尿液中尿素的量，診斷肝臟、腎臟病變谷氨酰胺酶谷氨酰胺測定腦脊液中谷氨酰胺的量，診斷肝昏迷、肝硬化膽固醇氧化酶膽固醇測定膽固醇含量，診斷高血脂等DNA聚合酶基因通過基因擴(kuò)增，基因測序，診斷基因變異、檢測癌基因402 酶在疾病治療方面的應(yīng)用酶 名來 源用 途淀粉酶胰臟、麥芽、微生

16、物治療消化不良，食欲不振蛋白酶胰臟、胃、植物、微生物治療消化不良，食欲不振，消炎，消腫，除去壞死組織，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，降低血壓脂肪酶胰臟、微生物治療消化不良，食欲不振纖維素酶霉菌治療消化不良，食欲不振溶菌酶蛋清、細(xì)菌治療各種細(xì)菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治療心肌梗塞，結(jié)膜下出血，黃斑部出血鏈激酶鏈球菌治療血栓性靜脈炎，咳痰，血腫，下出血，骨折青霉素酶蠟狀芽孢桿菌治療青霉素引起的變態(tài)反應(yīng)L-天冬酰胺酶大腸桿菌治療白血病超氧化物歧化酶微生物，植物，動物預(yù)防輻射損傷，治療紅斑狼瘡，皮肌炎，結(jié)腸炎凝血酶動物，蛇，細(xì)菌，酵母等治療各種出血病膠原酶細(xì)菌分解膠原，消炎，化膿，脫痂，治療潰瘍右旋糖酐酶微生物預(yù)防齲

17、齒 膽堿酯酶細(xì)菌治療皮膚病，支氣管炎，氣喘溶纖酶蚯蚓溶血栓彈性蛋白酶胰臟治療動脈硬化，降血脂核糖核酸酶胰臟抗感染，祛痰，治肝癌尿酸酶牛腎治療痛風(fēng)41溶菌酶423 酶在藥物制造方面的應(yīng)用 酶主要來源用途青霉素酰化酶微生物制造半合成青霉素和頭孢菌素11-羥化酶霉菌制造氫化可的松L-酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶細(xì)菌制造多巴（L-二羥苯丙氨酸）-酪氨酸酶植物制造多巴-甘露糖苷酶鏈霉菌制造高效鏈霉素核苷磷酸化酶微生物生產(chǎn)阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺苷）?；被崴饷肝⑸锷a(chǎn)L-氨基酸5-磷酸二酯酶桔青霉等微生物生產(chǎn)各種核苷酸多核苷酸磷酸化酶微生物生產(chǎn)聚肌胞，聚肌苷酸無色桿菌蛋白酶細(xì)菌由豬胰島素（Ala-30）轉(zhuǎn)變?yōu)槿?/p>

18、胰島素（Thr-30）核糖核酸酶微生物生產(chǎn)核苷酸蛋白酶動物、植物、微生物生產(chǎn)L-氨基酸-葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物生產(chǎn)人參皂甙-Rh243乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D AlaAminoacylase 氨 基 酰 化 酶44青霉素酰化酶與抗生素改造45淀粉酶類與淀粉糖業(yè)酶在食品方面的應(yīng)用46果汁生產(chǎn)與果膠酶乳制品與凝乳酶47酶在輕工、化工方面的應(yīng)用 用酶進(jìn)行原料處理用酶生產(chǎn)各種輕工、化工產(chǎn)品用酶增強(qiáng)產(chǎn)品的使用效果。 48酶水解了毛根部的毛囊蛋白而使毛松動脫落。蛋白酶分解皮纖維間質(zhì)中的可溶性蛋白質(zhì)，使皮纖維進(jìn)一步松散軟化。加速蛋白質(zhì)的分解染色溫度降低皮革脫毛與軟化加酶洗滌劑生絲

19、脫膠與羊毛染色蛋白酶回本章目錄49生物拋光是一種用纖維素酶改善纖維素纖維制品表面的整理工藝,以達(dá)到持久的抗起毛起球并增加織物的光潔度和柔軟度 50SOD51酶在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用環(huán)境監(jiān)測廢水處理過氧化物酶多酚氧化酶可降解材料開發(fā)52酶在生物技術(shù)方面的應(yīng)用除去細(xì)胞壁大分子切割大分子連接53 現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P伯格（美國,1926）在1960年以敏銳的科學(xué)預(yù)見力提出一個大膽的設(shè)想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動物體內(nèi)，以達(dá)到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎。 54 目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩55DNA 連接酶 “分子針線”限制性內(nèi)切酶 “分子手術(shù)刀 ”限制性酶活性緩沖液甲基化底物性狀56 一些限制性核酸內(nèi)切酶的來源與作用位點酶識別序列與作用位點53來 源Alu AGCTArthr