質粒提取及雙酶切鑒定

1、質粒提取及雙酶切鑒定質粒提取及雙酶切鑒定第1頁質粒DNA制備、判定內切酶切割重組質粒（p70、p81）質粒提取及雙酶切鑒定第2頁 一、概述什么是質粒（plasmid）質粒是存在于細菌體內一類獨立于染色體能夠自主復制雙鏈環(huán)狀DNA，在細胞內它們常以共價閉環(huán)超螺旋形式存在。 質粒提取及雙酶切鑒定第3頁質粒提取及雙酶切鑒定第4頁 質粒DNA普通特征： 質粒是細菌內共生型遺傳因子有相對獨立性。它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些表型。是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。質粒提取及雙酶切鑒定第5頁 質粒DNA與宿主菌染色體DNA兩點不一樣： 宿主菌染色體(chromosome)DNA通常比質粒DNA

2、要大得多。 純化分離宿主菌DNA多為線性分子，而質粒DNA呈閉合環(huán)形式。 質粒提取及雙酶切鑒定第6頁 提取質粒DNA目標與意義 是基因克隆(gene clone)第一步（分離得到轉運目標基因載體）； 為基因重組(gene recombination)作準備； 質粒能夠直接轉化(transform)細胞； 為目標基因(target gene)表示提供條件。質粒提取及雙酶切鑒定第7頁基因載體（gene vector）什么是基因載體 把一個有用目標DNA片斷經過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行復制和表示工具基因載體作用為目標基因提供進入受體細胞轉移能力為目標基因提供在受體細胞中復制（或整合）和表

3、示所需條件質粒提取及雙酶切鑒定第8頁基因載體應具備特點: 含有獨立復制能力，在細胞中能大量繁殖，從而使目標基因大量擴增 含有適當限制性內切酶識別和切割位點 含有供篩選取遺傳標識質粒提取及雙酶切鑒定第9頁 作為表示載體應能利用宿主酶系統(tǒng)，表示目標基因 相對分子量小 細胞內穩(wěn)定性高 可轉移性 基因載體類型 質粒，噬菌體(phage)，病毒(virus)DNA質粒提取及雙酶切鑒定第10頁二、質粒DNA提取原理與方法 核酸分離純化總標準： 確保核酸一級結構(primary structure)完整 排除其它分子污染（蛋白質、脂類、糖、有機溶劑、金屬離子、外源DNA、RNA等） 質粒提取及雙酶切鑒定第1

4、1頁 分離純化質粒DNA方法有很各種： 堿裂解法、煮沸法、high pure plasmid isolation kit等。各種方法原理相同，都是利用兩種DNA差異來分離，所以它們有共同步驟： 培養(yǎng)細菌使質粒擴增質粒提取及雙酶切鑒定第12頁 細菌搜集與裂解 搜集菌液高速離心方法 裂解細菌方法：去污劑法、有機溶劑法、堿裂解法、沸水裂解法、溶菌酶法、超聲處理法等。依據質粒大小、宿主菌菌株及裂解后純化方法等原因綜合后加以選擇。 質粒提取及雙酶切鑒定第13頁 質粒DNA純化 常見方法有：超速離心、層析法、聚乙二醇沉淀法等。 全部純化方法都是利用了質粒DNA相 對較小及共價閉合環(huán)狀性質。 質粒提取及雙酶

5、切鑒定第14頁 SDS堿裂解法制備質粒DNA原理： 在有EDTA及去污劑（SDS）存在條件下，用堿處理細菌，能夠使細菌細胞壁破裂，釋放出細胞內容物（染色體DNA、蛋白質和RNA等），強堿環(huán)境（pH12.012.6）能夠使細菌線性染色體片段氫鍵斷裂，雙鏈解開變性，而質粒DNA共價閉合環(huán)狀雙鏈并不完全分離，當加入高濃度酸性鹽時，pH值恢復至中性，并在有高鹽存在條件下：變性染色體DNA與變性蛋白質以及細胞碎片凝聚成不溶性沉淀物；質粒DNA又恢復天然構型，能溶解在上清液中，這么經過離心能夠把染色體DNA、蛋白質-SDS復合物等一起除去。質粒提取及雙酶切鑒定第15頁 SDS堿裂解法抽提質粒主要試劑 溶液

6、：由葡萄糖、EDTA、TrisCl組成. 葡萄糖作用是增加溶液粘度,減小抽提過程中機械剪切作用,預防破壞質粒。 EDTA 作用是絡合鎂等二價金屬離子,預防DNA 酶對質粒分子降解作用。 TrisCl調整溶菌液維持溶菌作用最適PH范圍。質粒提取及雙酶切鑒定第16頁 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成 SDS作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性； NaOH作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性。 溶液III：由冰醋酸和KAc組成。能中和溶液堿性，使質粒DNA復性，并為染色體DNA纏繞提供鹽環(huán)境。質粒提取及雙酶切鑒定第17頁 試驗步驟及注意事項： 加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12 0

7、00rpm30sec 棄上清，倒置EP管于衛(wèi)生紙上使液體流盡。加入100ul溶液I重懸沉淀，猛烈震蕩EP管，搖勻。加入200l溶液II，快速溫和顛倒數(shù)次加入150 l冰涼溶液III，顛倒10s，冰浴4min， 1rpm5min質粒提取及雙酶切鑒定第18頁 轉移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿（1:1）,混勻,1rpm 5min 轉移水相至新EP管，加兩倍體積無水乙醇，混勻，1rpm5min 棄上清，倒置管于衛(wèi)生紙上使液體流盡沉淀中加入1ml 70%乙醇， 1rpm5min去上清，靜置5min干燥,TE 20 l 溶解質粒，質粒提取及雙酶切鑒定第19頁注意事項： 1、加樣槍正確使用； 2、標識

8、自己所提取質粒類型（pUC119 或 pUC119-U6 ）； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾捅中； 4、加不一樣溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干； 6、轉移上清時不要吸到沉淀； 7、吸收酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到皮膚。質粒提取及雙酶切鑒定第20頁EcoR、Hind切割重組質粒質粒提取及雙酶切鑒定第21頁雙酶切體系： ddH2O 6l 質粒DNA 10l 10M buffer 2l EcoR 1l Hind 1l 累計 20l 質粒提取及雙酶切鑒定第22頁單酶切體系： ddH2O 7l 質粒DNA 10l 10M buffer 2l Hind 1l 累計 20l 質粒提取及雙酶切

9、鑒定第23頁限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶是識別DNA特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA一類內切酶。質粒提取及雙酶切鑒定第24頁限制性核酸內切酶存在于細菌體內切割不一樣起源DNA分子將產生特征性限制性酶切圖譜，含有重大應用價值（“分子手術刀”） 質粒提取及雙酶切鑒定第25頁作用與甲基化酶共同組成細菌限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護本身DNA。分類、（基因工程技術中常見型）質粒提取及雙酶切鑒定第26頁第一個字母取自產生該酶細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)覺先后次序。命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus i

10、nfluenzae d株流感嗜血桿菌d株第三種酶質粒提取及雙酶切鑒定第27頁類酶識別序列特點 回文結構(palindrome)切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG質粒提取及雙酶切鑒定第28頁Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口質粒提取及雙酶切鑒定第29頁影響限制酶活性原因1）“星”活性 酶特異性改變或特異性降低而展現(xiàn)活性。 EcoR：GAATTC EcoR*： AATT2）甲基化 識別序列中一些堿基甲基化后會妨礙酶活性。3）底物性狀4）試劑：緩沖系統(tǒng)質粒提取及雙酶切鑒定第30頁三、

11、DNA瓊脂糖凝膠電泳 原理 在pH8.0（堿性）環(huán)境中DNA磷酸基團解離，使DNA在該環(huán)境中帶負電荷，在電場中向正極方向泳動，因為各種DNA分子電荷數(shù)、分子量、構象不一樣，它們在經過凝膠立體網格時所受動力和阻力不一樣，所以泳動速度有差異，以此到達分離目標。 DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間氫鍵結合，在紫外光照射下呈橘紅色（530nm）熒光。質粒提取及雙酶切鑒定第31頁試驗步驟： 1、膠帶封制膠板兩端（示教）； 2、放好梳子，等膠稍稍冷卻后灌膠； 3、待膠凝固后撕去膠帶，將制膠板放在電泳槽中，輕輕拔掉梳子； 4、加樣（10l質粒和2l loading buffer在膠帶上混勻）； 5、接通電源，開始電泳（120V）; 6、藍色條帶快到終點時停頓電泳，EB染色5min； 7、漂洗后紫外燈下觀察結果。質粒提取及雙酶切鑒定第32頁注意： 1、灌膠時應防止出現(xiàn)氣泡； 2、拔梳子時