動植物細胞培養(yǎng)

1、動植物細胞培養(yǎng)第1頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一第六章 動植物細胞培養(yǎng)動植物細胞培養(yǎng)技術：將動植物組織、器官在適當的培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)的技術。組織：指由結構和功能相似的細胞和細胞間質組成，具有一定形態(tài)和生理功能的聚集體。器官：指機體中具有特殊結構和完成特殊功能的分化部分。組織與器官培養(yǎng)：在人工條件下，使它們得以繼續(xù)生存或發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。第2頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一第一節(jié) 動植物細胞培養(yǎng)的特性一、動物細胞培養(yǎng)的特性技術發(fā)展歷史：1907年，美國，Harrison首次將蛙的神經組織在試管內培養(yǎng)成功。1950年，Enders及同事發(fā)

2、表第一篇在培養(yǎng)細胞中生長病毒的報告。1972年，Knazek等創(chuàng)立中空纖維細胞培養(yǎng)技術，使細胞體外培養(yǎng)擴展為大規(guī)模培養(yǎng)。1986年，Demo生物公司用微囊化技術大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞生產單克隆抗體獲得成功。隨后，動物細胞培養(yǎng)技術日趨完善。第3頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一與微生物培養(yǎng)相比動物細胞培養(yǎng)特性：1、動物細胞無細胞壁，機械強度低，適應環(huán)境能力差；2、生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素。大多數哺乳動物細胞需附著在固體或半固體的表面才能生長；3、對營養(yǎng)要求嚴格；4、大規(guī)模培養(yǎng)時，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經驗。5、動物細胞培養(yǎng)基配方復雜，需補充血清和蛋

3、白胨。第4頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一大規(guī)模細胞培養(yǎng)的主要危害是微生物污染。設備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等的復雜性是引起微生物污染的主要原因。支原體的感染能力強，且不易檢出，對動物細胞培養(yǎng)的威脅最大。大規(guī)模細胞培養(yǎng)需要有一個設備精良的細胞庫（cell bank）。動物細胞的脆性是導致培養(yǎng)控制復雜化的關鍵。第5頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一動物細胞培養(yǎng)生產的產品疫苗干擾素單克隆抗體遺傳重組產品第6頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一動物細胞培養(yǎng)過程中的特征：生長速度慢，易受微生物污染，但可采用在培養(yǎng)過程中加入抗生

4、素等措施來解決。細胞個體大且無壁，對環(huán)境敏感，因此應慎重解決供氧（攪拌與通風）與細胞脆弱的矛盾。設備放大是一新課題，不能完全按照微生物反應過程的經驗。反應過程成本高，主要用于高附加值產物的生產。第7頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一二、植物細胞培養(yǎng)特性植物細胞培養(yǎng)發(fā)展歷史1902年，出生于奧地利的德國植物學家G.Haberlandt預言植物細胞培養(yǎng)的可能性。1937年，法國和美國科學家成功進行胡蘿卜和煙草的組織培養(yǎng)。1954年，Muir等第一次進行植物細胞懸浮培養(yǎng)。1966年，Klein指出利用植物細胞培養(yǎng)生產生化產品。第8頁，共79頁，2022年，5月20日，15點2

5、3分，星期一與微生物相比植物細胞的特性：1、細胞個大，細胞壁以纖維素為主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低。2、生長速率慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素。3、細胞培養(yǎng)需氧，但培養(yǎng)液黏度大，且不能強力通風攪拌。4、產物在細胞內，且產量低。5、培養(yǎng)中細胞常生長成各種大小的團塊，增加了懸浮培養(yǎng)的難度。第9頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一植物細胞培養(yǎng)的工業(yè)化產品：朝鮮參皂角苷、桉樹油、生物堿等。蘭花等名貴花卉、紫杉醇等植物細胞培養(yǎng)技術：誘導子、前體飼喂、兩相法培養(yǎng)、質體轉化、毛狀根、冠癭瘤組織培養(yǎng)，固定化技術。第10頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一

6、第二節(jié) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)一、動物細胞的形態(tài)二、動物細胞培養(yǎng)基三、動物細胞培養(yǎng)方法四、動物細胞培養(yǎng)技術和工藝第11頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一一、動物細胞的形態(tài)1、成纖維細胞型2、上皮細胞型3、游走細胞型4、多形性細胞型5、懸浮型細胞第12頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一1、成纖維細胞型這種細胞形態(tài)與體內成纖維細胞形態(tài)相似故而得名。細胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質向外伸出23個長短不同的突起。如血管內皮、心肌、平滑肌、成骨細胞等。第13頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一2、上皮細胞型細胞呈扁平的不規(guī)則

7、三角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密連接單層細胞片，起源于外胚層和內胚層組織的細胞，如皮膚表皮及衍生物（汗腺、皮脂腺等）。腸管上皮、肝、胰和肺泡上皮細胞。第14頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一 3、游走細胞型細胞的培養(yǎng)需要在支持物上生長，一般不連接成片，細胞胞質經常出現偽足和突起，呈活躍的游走和變形運動，速度快而且方向不規(guī)則。第15頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一 4、多形性細胞型除上述三種細胞外，還有一些組織和細胞，如神經組織的細胞等，難以確定它們的穩(wěn)定形態(tài)，可統(tǒng)歸多形性細胞。第16頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期

8、一5、懸浮型細胞這類細胞常呈圓形，不貼附在支持物上，呈現懸浮狀態(tài)生長。如血液細胞，淋巴組織細胞及腫瘤細胞。培養(yǎng)這類細胞也可采用微生物培養(yǎng)的方法進行懸浮物培養(yǎng)。第17頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一二、動物細胞培養(yǎng)基1、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求2、培養(yǎng)基組成3、常用的合成培養(yǎng)基4、培養(yǎng)基制備應考慮的因素第18頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一1、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求溫度來源不同的動物細胞，其最適的生長溫度是不盡相同的，昆蟲細胞的最適溫度是 2528，人和哺乳動物細胞的最適溫度37。鳥類細胞在38.5時生長最佳。動物細胞對低溫的耐受力比對高溫的耐受

9、力強，如溫度升至45時，1h內人和哺乳動物細胞將被殺死；相反，降低溫度把細胞置于2535時，細胞仍能生長，但速度減慢，并維持長時間不死。第19頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一pH值動物細胞合適的pH值一般在7.27.4，低于6.8或高于7.6時都對細胞產生不利的影響，嚴重時可導致細胞退變或死亡。原代培養(yǎng)細胞對pH值的變化耐受性差，傳代細胞對pH值變化的耐受性較強。對于大多數細胞來說，偏酸性環(huán)境比堿性環(huán)境更有利于細胞的生長。第20頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一營養(yǎng)成分營養(yǎng)物質包括碳源、氮源、氨基酸、無機鹽、微量元素、生長因子等。滲透壓等其它因

10、素滲透壓對動物細胞也有影響。其他因素如血清、剪切力等對細胞也有很大的影響。第21頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一支持物體外培養(yǎng)的大多數動物細胞需在人工支持物上單層生長，常用支持物有：玻璃、塑料制品、微載體（聚苯乙烯、交聯葡萄糖、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾丁質、明膠等）。氣體氧氣：氣相中最重要的成分是氧氣和二氧化碳。大多數動物細胞培養(yǎng)適合于大氣中的氧含量或更低些。據報道，對培養(yǎng)基硒含量的要求與氧濃度有關，硒有助于除去呈自由基狀態(tài)的氧。在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，氧可能成為細胞密度的限制因素。第22頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一CO2 ：氣相中的CO

11、2濃度直接調節(jié)溶解態(tài)CO2的濃度，溶解態(tài)的CO2受溫度影響， CO2溶于培養(yǎng)基中形成H2CO3，它又能再解離：由于HCO3-與多數陽離子的解離數很小，趨于結合態(tài)，故使培養(yǎng)基變酸。提高氣相中CO2 含量的結果是降低培養(yǎng)液pH值，第23頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一2、培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，是組織細胞培養(yǎng)最重要的條件。用于動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩大類。天然培養(yǎng)基：是使用最早、最為有效的動物細胞培養(yǎng)基，它主要取自于動物體液或從動物組織分離提取而得，其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點是成分復雜、個體差異大、來

12、源有限。第24頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一天然培養(yǎng)基的種類很多，包括生物性體液（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）等。血清：組織培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，血清中含有包括大分子的蛋白質和核酸等豐富的營養(yǎng)物質，對促進細胞生長繁殖、黏附及中和某些物質的毒性起著一定的作用。用于組織培養(yǎng)的血清種類很多，其來源主要是動物，有小牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎牛血清。第25頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一血漿：血漿不僅可用來支持培養(yǎng)組織塊，而且還供給細胞生長的營養(yǎng)物質，但由于血漿很容易發(fā)

13、生液化，目前已很少單獨使用。一般使用的是禽類血漿。組織浸出液：組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子的氨基酸，有促進細胞生長的作用。水解乳蛋白：是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白經水解而制得，氨基酸的含量較高。一般配制成0.5%的溶液，或與合成培養(yǎng)基以1：1共同使用。第26頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一合成培養(yǎng)基是根據天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質對細胞體內生存環(huán)境中各種已知物質在體外人工條件的模擬，經過反復實驗篩選、強化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的種類雖然很多，但一般都含有氨基酸、維生素、糖類、無機離子和一些其他輔助性成分。

14、氨基酸：是合成培養(yǎng)基的主要成分，合成培養(yǎng)基中的氨基酸是以必需氨基酸為主。幾乎所有的細胞對谷氨酰胺都有較高的要求。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質。第27頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質，它們在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞的代謝有重大的影響。糖類：多數合成培養(yǎng)基都含有葡萄糖，它主要由糖酵解作用代謝形成丙酮酸，并可轉化乳酸或乙酰乙酸進入檸檬酸循環(huán)形成CO2。對胚胎細胞和轉化細胞，乳酸在培養(yǎng)基中的積累特別明顯。無機離子：是細胞的重要組成部分之一，參與了細胞的代謝活動。培養(yǎng)基中的無機離子除K+、Na+等外，還含有Fe2+、Zn2

15、+、Cu2+等微量離子。第28頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一其他成分：在一些合成培養(yǎng)基中還含有一些代謝的中間產物、氧化還原劑、三磷酸腺苷、輔酶A等成分。盡管現在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經較為復雜，但仍然不能完全滿足體外培養(yǎng)細胞生長的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補充。第29頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一3、常用的合成培養(yǎng)基目前合成培養(yǎng)基的種類已有數十種，大多數培養(yǎng)基都是為適應某種組織細胞的生長而在某種合成培養(yǎng)基的基礎上改良而來的。目前較為常用的有199培養(yǎng)液、Eagle（MEM、DMEM）培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)

16、液、HAM培養(yǎng)液等。第30頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一第31頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一無血清培養(yǎng)基一般由基礎培養(yǎng)液和替代血清的補充因子組成：基礎培養(yǎng)基：是各種營養(yǎng)物質的混合物，是維持組織或細胞生長、發(fā)育、遺傳、繁殖等一系列生命活動比不可少的物質，基礎培養(yǎng)基的成分是完全已知的，而且可以按照細胞的不同營養(yǎng)要求增加或減少某些組分。補充因子：是用來替代血清的各種因子的總稱。其種類很多，包括大分子、小分子物質和微量元素等。補充因子又可分為必需補充因子和特殊補充因子。第32頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一三類無血清培養(yǎng)

17、基：類型確定程度優(yōu)點缺點123無蛋白質，所有成分明確含有純化蛋白和激素非確定性生物添加劑取代血清化學成分完全明確應用較廣價格低廉，可以滅菌只適用于一些確立細胞系相對比較昂貴化學成分不太明確第33頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一4、培養(yǎng)基制備應考慮的因素（1）pH值：一般正常的成纖維細胞系以pH=7.47.7最好，轉化細胞以7.07.4更合適，上皮細胞5.5合適。（2）緩沖能力：碳酸鹽緩沖系統(tǒng)由于毒性小、成本低，對培養(yǎng)物有營養(yǎng)作用，因此比其他緩沖系統(tǒng)用得多。但在生理pH值條件下的緩沖能力差。 （3）滲透壓：一般常用冰點降低或蒸汽壓升高測定。（4）黏度：培養(yǎng)基黏度受血清含

18、量影響，在多數情況下，對細胞生長沒有什么影響。第34頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一三、動物細胞培養(yǎng)方法動物細胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)第35頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一1、懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程，主要用于非帖壁依賴性細胞的培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)對設備的要求簡單，但是懸浮培養(yǎng)的細胞密度較低，轉化細胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險，培養(yǎng)病毒易失去病毒標記而降低免疫能力。第36頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一2、貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)是指必須貼附在固體介質表面上生長的細胞培養(yǎng)，主要用于非淋巴組織和多

19、異倍體等貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。由于大多數動物細胞屬于貼壁依賴性細胞，貼壁培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)的一種重要方法。第37頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一細胞貼壁一般分為貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼壁于培養(yǎng)表面和壁細胞在培養(yǎng)表面上擴展等幾個步驟。第38頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一3、固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)是既適用于帖壁依賴性細胞，有適用于非帖壁依賴性細胞的包埋培養(yǎng)方式，具有細胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點。一般對于貼壁依賴性細胞通常采用膠原包埋，而對于非貼壁依賴性細胞則常用海藻酸鈣包埋。常用的細胞固定化的方法主要有吸附、

20、共價帖附、離子/共價交聯、包埋和微囊化等。第39頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一四、動物細胞培養(yǎng)技術和工藝大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的工藝流程第40頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一工藝過程中，先將組織切成碎片，然后用溶解蛋白質的酶處理而得到單個細胞，再用離心法收集細胞。將細胞植入營養(yǎng)培養(yǎng)基，使細胞在培養(yǎng)基中增殖到覆蓋瓶壁表面，用酶把細胞從瓶壁上消化下來，再接種到若干培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得的細胞“種子”冷藏于液氮中，從液氮中取出一部分細胞“種子”進行解凍、復活培養(yǎng)，進行擴大培養(yǎng)以獲得足夠的細胞量，將細胞接種于大規(guī)模生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，

21、按照產物的不同形式進行產物分離純化。第41頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一第三節(jié) 植物細胞的培養(yǎng)一、植物細胞培養(yǎng)流程二、植物細胞培養(yǎng)基的組成三、植物細胞培養(yǎng)的方法四、植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術五、影響植物細胞培養(yǎng)的因素第42頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下培養(yǎng)植物細胞的方法。將愈創(chuàng)組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，使組織分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，獲得大量的細胞群體。小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中進行，大規(guī)?？衫冒l(fā)酵罐生產。第43頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，

22、星期一植物細胞培養(yǎng)能生產一些微生物所不能合成的特有代謝產物，如生物堿類（尼古丁、阿托品、番茄堿等）、色素（葉綠素、類胡蘿卜素、葉黃素等）、類黃酮和花色苷、苯酚、皂角苷、固醇類、萜類、某些抗生素和生長控制劑（赤霉素等）、調味品和香料等。細胞培養(yǎng)用于種苗生產，如蘭花等名貴花卉和谷物良種的培育，可不受外界環(huán)境的影響。第44頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一工業(yè)化生產的植物細胞培養(yǎng)產物第45頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一一、植物細胞培養(yǎng)流程植物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)類似，可采用液體培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)。植物組織細胞的分離，一般采用次氯酸鹽的稀溶液、福爾馬

23、林、酒精等消毒劑對植物體或種子進行滅菌消毒。種子消毒后在無菌狀態(tài)下發(fā)芽，將其組織的一部分在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨著細胞增殖形成不定形細胞團（愈創(chuàng)組織），將此愈創(chuàng)組織移入液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，愈創(chuàng)化時間隨植物種類和培養(yǎng)基條件而異，慢的需幾周以上，一旦增殖開始，就可用反復繼代培養(yǎng)加快細胞生殖。繼代培養(yǎng)可用試管或燒瓶等，大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)可用傳統(tǒng)的機械攪拌罐、氣升式發(fā)酵罐。第46頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一植物細胞大量培養(yǎng)流程及培養(yǎng)系統(tǒng)第47頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一二、植物細胞培養(yǎng)基的組成植物細胞培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)相比，其最大的優(yōu)點是植物細

24、胞能在簡單的合成培養(yǎng)基上生長。其培養(yǎng)基的成分由碳源、有機氮源、無機鹽類、維生素、植物生長激素和有機酸等其他物質組成。第48頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一常用的植物細胞培養(yǎng)基配比第49頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一1、碳源：蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前二者差。其他的碳水化合物不適合作為單一的碳源。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可增加培養(yǎng)細胞的次生代謝產物量。2、有機氮源：通常采用的有機氮源有蛋白質水解物（包括酪蛋白質水解物）、谷氨酸胺或氨基酸混合物。有機氮源對細胞的初級培養(yǎng)的早期生長階段有利。L-谷氨酰胺可代替或補充某種蛋白質水解物。第

25、50頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一3、無機鹽類：通常在培養(yǎng)基中無機鹽的濃度應在25mmol左右。硝酸鹽濃度一般采用2540mmol/L，雖然硝酸鹽可以單獨成為無機氮源，但是加入銨鹽對細胞生長有利，如果添加一些琥珀酸或其他有機酸，銨鹽也能單獨成為氮源。培養(yǎng)基中必須添加鉀元素，其濃度為20mmol/L，磷、鎂、鈣和硫元素的濃度在13mmol/L之間。第51頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一4、植物生長激素：大多數植物細胞培養(yǎng)基中都含有天然的和合成的植物生長激素。激素分成兩類既生長素和分裂素。生長素在植物細胞和組織培養(yǎng)中可促使根的形成，最有效和最常

26、用的有吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸和奈乙酸。分裂素通常是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-卞基氨基嘌呤（BA）和玉米素（Z）。分裂素和生長素通常是一起使用，促使細胞分裂、生長。其使用量在0.110mg/L之間，根據不同細胞株而異。第52頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一5、有機酸：加入丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、能夠保證植物細胞在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基上生長，并且耐受鉀鹽的能力至少提高到10mmol。6、復合物質：通常作為細胞的生長調節(jié)劑如酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁。但在許多例子中發(fā)現，有些抽提液對細胞有毒性。目前仍在廣泛使用的是椰

27、子汁，在培養(yǎng)基中濃度是115mmol/L 。第53頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一植物細胞培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基中使用的無機鹽、碳源、維生素、有機酸和植物生長激素都應該采用最高純度級的試劑和藥品。難溶的激素，配制時可先溶于25ml的酒精中。配制培養(yǎng)基的用水應嚴格采用蒸餾水或高純度的去離子水。配制好的培養(yǎng)基按要求裝入三角瓶或試管中，121下滅菌20min，待冷卻后就可使用。對于一些熱敏性化合物，滅菌時不可采用加熱法，而應該采用過濾法滅菌，然后無菌操作加入到已滅菌的培養(yǎng)基。第54頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一三、植物細胞培養(yǎng)的方法1、單倍體細胞培養(yǎng)

28、2、原生質體培養(yǎng)3、固體培養(yǎng)4、液體培養(yǎng)5、懸浮培養(yǎng)6、固定化培養(yǎng)第55頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一1、單倍體細胞培養(yǎng)主要用花藥在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，可以從小孢子（雄性生殖細胞）直接發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者是通過愈創(chuàng)組織誘導分化出芽和根，最終長成植株。第56頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一2、原生質體培養(yǎng)植物的體細胞（二倍體細胞）經過纖維素酶處理后可去掉細胞壁，獲得的去壁細胞稱為原生質體。該原生質體在良好的無菌培養(yǎng)基中可以生長、分裂，最終可以長成植株。實際過程中，也可以用不同植物的原生質體進行融合與體細胞雜交，由此可獲得體

29、細胞雜交的植株。第57頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一3、固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)的基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)方法。固體培養(yǎng)基的凝固劑除特殊研究外，幾乎都使用瓊脂，濃度一般為610%。接種材料放在培養(yǎng)基上，原生質體固體培養(yǎng)則需混入培養(yǎng)基內進行嵌合培養(yǎng)，或者使原生質體在固體-液體之間進行雙相培養(yǎng)。第58頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一4、液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)也是在微生物培養(yǎng)的基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)方法。液體培養(yǎng)基可分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)等兩類。靜止培養(yǎng)不需要任何設備，適合于某些原生質體的培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)需要搖床等設備使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基保持

30、充分混合以利于氣體交換。第59頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一5、懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是一種使組織培養(yǎng)物分離成單細胞并不斷擴增的方法。在進行細胞培養(yǎng)時，需要提供容易破裂的愈創(chuàng)組織進行液體振蕩培養(yǎng)，愈傷組織經過懸浮培養(yǎng)可以產生比較純一的單細胞。用于懸浮培養(yǎng)的愈傷組織應該是易碎的，這樣在液體培養(yǎng)條件下能獲得分散的單細胞，而緊密不易碎的愈傷組織就不能達到上述目的。第60頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一6、固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)是在微生物和酶的固定化培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)方法。該法與固定化酶或微生物細胞類似，應用最廣泛的、能夠保持細胞活性的固定化

31、方法是將細胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。第61頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一四、植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術1、植物細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)2、植物細胞或原生質體的固定化培養(yǎng)3、植物細胞培養(yǎng)方式第62頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一1、植物細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)通常采用水平振蕩，可變速率為30150r/min，振蕩24cm，溫度2430。適合于愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基不一定適合懸浮細胞培養(yǎng)，實際過程中就需要尋找適合于懸浮培養(yǎng)物快速生長、有利于細胞分散和保持分化再生能力的培養(yǎng)基。第63頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一（1）、

32、懸浮培養(yǎng)中的植物細胞特性與微生物細胞相比，植物細胞大的多，平均直徑比微生物細胞大30100倍。植物細胞很少以單一細胞形式懸浮生長，而通常以細胞數在2200之間、直徑2mm左右的非均相集合細胞團的方式存在。第64頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一植物細胞的纖維素細胞壁使得其外骨架相當脆弱，這樣植物細胞雖有很強的抗性強度，但抗剪切能力相當弱，使得傳統(tǒng)攪拌微生物反應器中高剪切力很容易損壞植物細胞的細胞壁。由于植物細胞生長速度慢，操作周期就很長，即使間歇操作也要23周，半連續(xù)或連續(xù)操作更是可長達23個月，因此，在植物細胞培養(yǎng)過程中，保持無菌有一定難度，但是相當重要。第65頁，共

33、79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一（2）植物細胞培養(yǎng)液的流變特性由于植物細胞常趨于成團，且不少細胞在培養(yǎng)過程中容易產生粘多糖等物質，使傳氧速率等降低，影響了細胞的生長。人們常用黏度來描述培養(yǎng)液的流變特征。第66頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一（3）植物細胞培養(yǎng)過程中的氧傳遞所有的植物細胞都是好氣性的，需要連續(xù)供氧。由于植物細胞培養(yǎng)時對溶氧的變化非常敏感，太高太低都會對培養(yǎng)過程產生不良的影響，因此，大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)對供氧和尾氣氧的監(jiān)控十分重要。與微生物培養(yǎng)過程相反，植物細胞培養(yǎng)過程并不需要高的氣液傳質速率，而是要控制供氧量，以保持較低的溶氧水平。第67頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一2、植物細胞或原生質體的固定化培養(yǎng)（1）植物細胞固定化海藻酸鹽固定化卡拉膠固定化瓊脂糖固定化瓊脂固定化（2）原生質體固定化第68頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一3、植物細胞培養(yǎng)方式間歇培養(yǎng)：流加間歇培養(yǎng)兩級或多級間歇培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)：單級連續(xù)培養(yǎng)多級連續(xù)培養(yǎng)回流式連續(xù)培養(yǎng)固定化細胞培養(yǎng)第69頁，共79頁，2022年，5月20日，15點23分，星期一五、影響植物細胞培養(yǎng)的因素1、細